Sacarificação de resíduos celulósicos com bactérias




INTRODUÇÃO

O efeito estufa é produto da ação de uma camada de gases que envolvem a
atmosfera e prendem a energia no planeta. Trata-se de um fenômeno natural, mas
durante os últimos anos aumentou devido aos processos de combustão provocados
pelo homem, principalmente os associados à queima de hidrocarbonetos, como o
aumento da frota automobilística e das atividades industriais. Entre os gases mais
tóxicos envolvidos no efeito estufa, podem-se citar o dióxido de carbono (CO2),
o metano, o óxido de azoto e os clorofluorcarbonos (CFCs). Devido ao fato de ainda
não termos tomado medidas drásticas de forma a controlar a emissão de gases de
efeito estufa, é quase certo que teremos que enfrentar um aumento da temperatura
global. Entre os efeitos das mudanças climáticas podem ser descritas inundações,
ondas de calor, disseminação de doenças, etc. Como exemplo das conseqüências do
efeito estufa, no ano de 2003, a Europa sofreu com temperaturas extremamente
elevadas, o que acarretou em Paris, um incremento de 140% no número de mortes
em relação aos anos anteriores (Vandentorren et al., 2004). Também são incluídos
como possíveis conseqüências do efeito estufa o derretimento de geleiras em
montanhas, o desprendimento de icebergs e a elevação do nível do mar (Vogt, 2006).
Projeções de aumento significativo de temperatura são estimadas para as próximas
décadas. Segundo o Intergovernmental Panel on Climate Change (IPCC), entre os
anos de 2021-2050 somente os gases de efeito estufa contribuirão com aumento de
1,6 °C na temperatura da Terra (intervalo de 1,0-2,1 °C) (Houghton et al., 2001).
A fim de reduzir os impactos nas próximas gerações, em 1997 foi estabelecido
um acordo internacional conhecido como Protocolo de Kyoto. Os países desenvolvidos
signatários deste documento se comprometeram, a partir de fevereiro de 2005,
a reduzir as emissões de gases-estufa e garantir um modelo de crescimento limpo
nos países em desenvolvimento. O documento prevê que entre 2008 e 2012, os países
desenvolvidos reduzam suas emissões em 5,2% em relação aos níveis medidos em
1990. Entre os países signatários (atualmente 161), o Brasil também participa na
categoria de país em desenvolvimento (UNFCCC, 2006). Apesar de não ser obrigado
a atingir as metas de redução até 2012, o Brasil há muitos anos vem colaborando na
redução da emissão de gases de efeito estufa, por meio da implementação de
programas estimulando o uso de combustíveis renováveis. Tal parcela de contribuição
é muito importante, pois, dados mundiais de 1995, indicam que o setor de transportes
é responsável por 22% de todo o dióxido de carbono produzido, e anualmente, este
valor aumenta em cerca de 2,5% (Nakicenovic e Swart, 2000). O Brasil entrou na
tecnologia dos biocombustíveis em 1974, com o início do Programa Nacional do
Álcool - Proálcool. Em poucos anos, com o desenvolvimento tecnológico automotivo
e da produção de álcool, carros movidos exclusivamente a álcool foram lançados.
Apenas uma década depois do início do programa, a produção de álcool era plena e
nove em cada dez carros novos eram movidos a álcool. O Proálcool criou mais de
500 mil empregos e permitiu que o Brasil reduzisse a importação de petróleo.
Entretanto, uma brusca redução no preço do petróleo bem como modificações na
política nacional do álcool, fizeram com que a aquisição de carros a álcool declinasse
na década de 90, atingindo um mínimo de 0,1% em 1998 (Houghton et al., 2001).
Apesar disso, é estimado que o uso do álcool entre 1975 e 1998, possa ter evitado a
emissão de 385 Mt de CO2 (Pinguelli e Ribeiro, 1998).
Atualmente, o Brasil produz o álcool hidratado usado para mover veículos a
álcool e bi-combustíveis. Também o álcool anidro é adicionado à gasolina na
proporção de 25%. Segundo Nakicenovic e Swart (2000), a adição do álcool à
gasolina representa uma redução anual de 11% na emissão de dióxido de carbono.
Além disso, tal procedimento eliminou totalmente os aditivos ambientais venenosos
(chumbo tetraetila e o MTBE – metil-tércio-butil-éter, originário do petróleo) da
matriz de combustíveis brasileira, contribuindo significativamente na redução de
poluentes. Portanto, o uso do álcool combustível no Brasil tem impulsionado o
desenvolvimento tecnológico, assegurando o suprimento de energia, gerando
empregos, evitando a poluição local e contribuindo para a redução do efeito estufa
(Houghton et al., 2001).

REVISÃO DA LITERATURA

A celulose é o constituinte principal dos vegetais, consistindo na matéria orgânica
mais abundante do mundo. A estrutura básica desse material consiste de um polímero
linear com 8.000-12.000 unidades de glicose, unidas entre si por ligações 1,4-beta-
glicosídicas. Nos vegetais, a molécula de celulose é arranjada em fibrilas consistindo
de várias moléculas de celulose paralelas unidas por pontes de hidrogênio, as quais
ocorrem ligadas à lignina e à hemicelulose (Matulova et al., 2005). Como resultado
da associação dos diferentes tipos de polímeros que compõem a matéria vegetal,
obtém-se um material de estrutura rígida e resistente ao ataque enzimático, dessa
forma a degradação da celulose na natureza ocorre lentamente (Enari, 1983).
Dentre os materiais que fazem parte dos subprodutos gerados pela agroindústria,
a celulose apresenta-se como um dos mais abundantes, estando presente em resíduos,
tais como: bagaço da cana-de-açúcar, casca de arroz, palha de milho, serragem,
entre outros. Por exemplo, o bagaço da cana-de-açúcar tem sido descartado em rios
acarretando a lixiviação dos mesmos. Já os resíduos da produção de arroz, quando
não são queimados para a geração de energia, são depositados em estradas vicinais
ou lançados clandestinamente nos mananciais de água, acarretando graves problemas
ambientais (Della, 2005). Em termos nacionais, a geração de resíduos celulósicos
como o bagaço de cana-de-açúcar e a casca de arroz podem ser estimados em
aproximadamente 60 e 2 Mt/ano, respectivamente (CEPA/SC, 2004; PROCANA,
2007). Felizmente, grande parte do bagaço de cana-de-açúcar produzido,
principalmente o material proveniente do estado de São Paulo, tem sido queimado
para a geração de energia elétrica. Apesar dos benefícios advindos dessa prática,
esta também contribui com a emissão de CO2 para a atmosfera.
Como alternativa ao destino dado aos resíduos celulósicos, estes poderiam ser
gerenciados de forma que benefícios interessantes pudessem ser atingidos tanto do
ponto de vista ambiental quanto econômico. Isto porque a celulose presente na
composição desses subprodutos pode ser hidrolisada enzimaticamente pela ação de
microrganismos para a geração de glicose, pelo processo chamado sacarificação.
Segundo Pandey e Pandey (2002), a casca de arroz é composta por 52% de celulose,
28% de lignina e de 20% de hemicelulose. O mesmo ocorre com o bagaço de cana-
de-açúcar que apresenta aproximadamente 46,6% (+ 8,6) de celulose, 25,2% (+ 4,3)
de hemicelulose e 20,7% (+ 5,4) de lignina (Toit et al., 1984; Monteiro et al., 1991;
Pandey e Pandey, 2002;). Portanto, a riqueza em celulose desses dois resíduos, bem
como sua disponibilidade a um baixo custo, representam um importante recurso para
a produção de glicose via processo de sacarificação (Reyes et al., 1998; Fujita et al.,
2004).

A produção de etanol, ou a síntese de qualquer produto de origem microbiana
a partir de resíduos celulósicos, inicia-se pela deslignificação do material
lignocelulósico, ocasionando assim a separação da celulose, hemicelulose e lignina.
Para a realização desta separação, já foram descritos diferentes tipos de processos,
dentre os quais podem ser destacados o uso de ácidos (Fogel et al., 2005; Reyes et
al., 1998) ou o emprego de vapor (Moniruzzaman, 1996). Em seguida, deve ocorrer
a despolimerização da celulose e da hemicelulose para liberação de açúcares, os
quais serão utilizados pelo microrganismo para a síntese do produto de interesse.
Entre os principais produtos que podem ser gerados por este procedimento,
destacam-se o etanol (Grohmann, 1993; Lee, 1997; Krishna e Chowdary, 2000;
Mielenz, 2001; Lawford e Rousseau, 2003), açúcares (Fogel et al., 2005),
bioplástico (Silva et al., 2004), ácidos orgânicos (Tanaka et al., 2006), Single Cell
Protein (SCP), enzimas, etc.
Na grande maioria dos processos estudados nos países da América do Norte e
Europa, a conversão da celulose em monossacarídeos tem sido efetuada por meio do
emprego de enzimas conhecidas como celulases (Kennedy e Hossain, 1992; Hayn et
al., 1993; Lynd et al., 2002; Fujita et al., 2004). Estes monossacarídeos são
posteriormente convertidos em etanol (Grohmann, 1993; Lee, 1997). Segundo o IPCC
(Houghton et al., 2001), o National Renewable Energy Laboratory dos Estados
Unidos, há cerca de dez anos mantêm uma planta que processa enzimaticamente
uma tonelada/dia de resíduos celulósicos. Este processo tem sido estimulado e
destacado pelo IPCC, pois permite a produção de combustíveis renováveis, além de
reduzir a emissão de gases com efeito-estufa (Lynd et al., 1991).
Atualmente, muito se conhece sobre o processo de hidrólise da celulose cristalina
à glicose, sendo determinado que no mínimo três grupos de celulases estão envolvidos
(Nakari-Setala e Penttila, 1995; Seiboth et al., 1997; Srisodsuk et al., 1997; Cohen et
al., 2005). Dezenas de celulases já foram descritas entre os mais diversos grupos
microbianos. Muitas vezes, estas enzimas além de terem sido isoladas e caracterizadas,
também tiveram o gene que as codifica determinado. Segundo Lynd et al. (2002), as
celulases atuam de forma sinérgica e diferentemente conforme o organismo e o
substrato, e podem ser genericamente caracterizadas como: beta-endoglucanases,
beta-exoglucanases ou celobiohidrolases e beta-glucosidases. As endoglucanases (EC3.2.1.4) hidrolisam internamente ligações glicosídicas (â-1,4), atuando sobre celo-oligossacarídeos, celulose contendo ácido fosfórico, celulose substituída como carboximetilcelulose (CMC) e hidroxietilcelulose (HEC); porém não atacam a
celobiose. As exoglucanases (EC 3.2.1.91) clivam a celulose e celo-oligossacarídeos
a partir do terminal redutor e não redutor da cadeia desses polímeros, liberando o
dissacarídeo de celobiose. Esta enzima não ataca celulose substituída e celobiose.
Finalmente as beta-1,4 glucosidases (EC 3.2.1.21), hidrolisam a celobiose e outros
celo-oligossacarídeos curtos à glicose. Neste contexto, o uso de microrganismos
superprodutores de celulases, ou celulases melhoradas têm despertado interesse (Lima,
2001; Mielenz, 2001; Fujita et al., 2004; Lima et al., 2005), tendo em vista que
algumas celulases naturais evoluíram somente para satisfazer as necessidades do
próprio microrganismo e não a total sacarificação da celulose, como seria desejado
em um processo industrial.
Para o uso de microrganismos na produção de álcool ou de qualquer outro
produto, a partir de resíduos celulósicos como substrato, podem ser empregadas
basicamente duas estratégias. A primeira, que utiliza dois organismos, um responsável
pela sacarificação do resíduo e o outro pela síntese do produto em si. O segundo
processo é conhecido como Simultaneous Saccharification and Fermentation (SSF).
Neste, o microrganismo além de ser capaz de produzir álcool, ou outro produto,
também é apto a sintetizar celulases, ou estas são adicionadas ao sistema durante o
cultivo (Krishna e Chowdary, 2000; Mielenz, 2001). Nestes processos, os principais
procariotos produtores de celulases utilizados são Bacillus spp., Erwinia
chrysanthemi, Pseudomonas fluorescens, Acetobacter xylinum, etc. Entre as bactérias
produtoras de etanol destacam-se Klebsiella oxytoca, Zymomonas mobilis,
Clostridium thermosacharolyticum, Clostridium thermocellum e Cellulomonas fimi;
sendo as duas últimas celulolíticas (Lynd et al., 2002; Demain et al., 2005). Entre os
principais eucariotos enquadram-se Trichoderma reesei, como produtor de celulases
e Saccharomyces cerevisiae, como produtor de etanol. Segundo dados da literatura,
as pesquisas que têm como objetivo o melhoramento dos resultados obtidos nos
processos de bioconversão de resíduos celulósicos, baseiam-se principalmente na
otimização das propriedades das celulases utilizadas no processo (resistência a
variações de pH do meio, termoestabilidade, etc.); bem como no melhoramento dos
organismos capazes de realizar ambos os processos de bioconversão e geração de
produtos de interesse econômico.
Com o objetivo de tornar os processos de bioconversão mais eficientes,
atualmente os pesquisadores têm empregado métodos de engenharia genética,
metabólica e de proteínas (Aristidou e Penttila, 2000; Kataeva et al., 2001; Lynd et
al., 2002; Bro et al., 2006). Para tanto, os genes de interesse podem ser inseridos em
vetores de expressão (plasmídios, cosmídios, etc.) e então introduzidos por
transformação genética em determinados organismos. Uma vez na célula receptora,
o DNA exógeno pode integrar-se ao genoma ou permanecer na forma
extracromossômica. Em ambos os casos, a expressão do gene de interesse, conhecida
como expressão heteróloga, pode viabilizar a produção da proteína na célula
hospedeira. Assim, podem ser criados microrganismos designados para atividades
específicas, os quais muitas vezes não ocorrem na natureza, e podem ser aplicados
em determinados processos industriais.
Especificamente, no que se refere ao melhoramento de microrganismos para o
processo de bioconversão de resíduos celulósicos a etanol, podemos citar vários
casos. Por exemplo, Minamiguchi et al. (1995) conferiram a levedura S. cerevisiae a
capacidade de expressar uma endoglucanase do fungo filamentoso Aspergillus
aculeatus. Já Murai et al. (1998), obtiveram uma linhagem de S. cerevisiae capaz de
produzir as enzimas beta-glucosidase e FI-carboximetilcelulase de A. aculeatus;
tornando esta levedura produtora de etanol e capaz de crescer em meios de cultura
contendo como única fonte de carbono os açúcares celobiose e celo-oligossacarídeos.
A eficiente conversão da molécula de celulose a etanol também foi realizada por
Fujita et al. (2002). Neste caso, a levedura expressava a â-glucosidase I de A. aculeatus
e a endoglucanase II de T. reesei. Em um novo ensaio, foi introduzido na levedura
mais gene para uma exoglucanase, que melhorou ainda mais a performance desse
microrganismo (Fujita et al., 2004).
São vários os relatos de melhoria da bioconversão da celulose por meio do
emprego de microrganismos procariotos geneticamente modificados. Entre estes,
Wood e Ingram (1992) descreveram a transformação da bactéria Klebsiella oxytoca,
previamente alterada com os genes para a síntese de etanol de Zymomonas mobilis.
Além destes genes, foram introduzidos neste organismo genes de endoglucanases de
C. thermocellum, os quais permitiram a degradação de celulose e síntese de etanol.
Resultados positivos também foram obtidos com a introdução de genes de celulases
no organismo naturalmente produtor de etanol Zymomonas mobilis (Brestic-Goachet
et al., 1989). Os genes inseridos foram obtidos a partir dos microrganismos Erwinia
chrysanthemi e Acetobacter xylinum; sendo este último introduzido também em E.
coli (Okamoto et al., 1994). Dentre as várias construções de celulases que já foram
expressas com eficiência em E. coli, pode-se citar a expressão da fusão protéica b-
glucosidase A (BglA) do organismo hipertermofílico Fervidobacterium sp. (Lima,
2001), bem como a clonagem e superproduçäo de uma endoglucanase termoestável,
muito interessante para processos industriais, a EglA de Bacillus pumilus (Lima et
al., 2005). Em ambos os casos, estas celulases foram ativas e permitiram que o
microrganismo recombinante fosse capaz de hidrolisar parcialmente substratos
celulósicos. Um cassete de celulases foi construído, contendo as duas enzimas
mencionadas anteriormente (BglA e EglA). O vetor foi introduzido em E. coli e
conferiu a esta bactéria a capacidade de utilizar CMC como única fonte de carbono
para a sua multiplicação (Rodrigues, 2004). Como exemplo de sucesso de SSF com
procariotos, podemos destacar um dos trabalhos de Zhou e Ingram (1999). Neste, K.
oxytoca, contendo os genes relacionados à síntese de etanol (pdc e adhB) de Z.
mobilis integrados ao genoma e um plasmídio com genes de celulases (celY e celZ)
de E. crysanthemi, foi capaz de converter 76% de celulose amorfa em etanol. Outro
exemplo foi a capacitação da bactéria Clostridium acetobutylicum, produtora de
solventes de interesse industrial, como o butanol, para a utilização de celulose como
fonte de carbono e energia (Mingardon et al., 2005). Neste caso, genes necessários
ao metabolismo da celulose foram clonados a partir do microrganismo Clostridium
cellulolyticum, permitindo que Clostridium acetobutylicum pudesse expressar as
enzimas necessárias à degradação da celulose.
Além dos trabalhos descritos, muitos outros provam que a expressão heteróloga
de celulases e/ou genes para a síntese de etanol em procariotos, representa uma
eficiente estratégia para a questão da bioconversão de resíduos celulósicos. Nestes
trabalhos, um ponto importante verificado foi a seleção de promotores constitutivos
eficientes, isto é, não dependentes de indução e não vulneráveis à inibição. Por
exemplo, Lynd et al. (2002) descreveram avanços com a introdução de promotores
de Z. mobilis, para a síntese de celZ de E. chrysanthemi em E. coli. O organismo
obtido foi capaz de secretar 50% da proteína, a qual perfazia 5% do total da proteína
celular. Na construção descrita por Rodrigues (2004), foi utilizado um promotor de
B. pumilus que além de ser eficiente nas bactérias E. coli e B. pumilus, também
mostrou-se apto a induzir de forma constitutiva a transcrição em Enterobacter cloacae
e Methylobacterium sp.

DISCUSSÃO

A conversão microbiológica de resíduos celulósicos da agroindústria é uma
interessante estratégia no combate aos gases de efeito estufa. Tal procedimento tem
especial potencial para o Brasil, devido à importância econômica da agroindústria
nacional. Em nosso país, são várias as culturas (cana-de-açúcar, arroz, milho, soja,
etc) que geram bagaços, palhas e cascas como sub-produtos. Neste contexto, métodos
que permitam a melhoria da eficiência do processo de sacarificação certamente são
de grande valia.
Devido aos grandes avanços ocorridos na área da genética molecular nos últimos
anos, a construção de microrganismos, geneticamente modificados, capazes de
hidrolisar mais eficientemente a celulose é uma realidade. Exemplos de sucesso
incluem a inserção de genes de celulases de diferentes organismos, ou até mesmo, a
inclusão de genes relacionados à produção de etanol. Inovações como estas que
permitam o uso de resíduos para a ampliação da produção de etanol ou a redução de
custos de produção, certamente favorecem sua inserção definitiva em nosso cotidiano,
e conseqüentemente, contribuem para um desenvolvimento social/econômico mais
harmônico com o meio ambiente.
A busca pelo etanol como alternativa aos combustíveis fósseis, tornou o Brasil
um dos principais candidatos para o fornecimento desse combustível, ou sua tecnologia
de produção, a outros países, como por exemplo, para o Japão e Estados Unidos
(Orellana e Neto, 2006). Dessa forma, é certo considerar que a grande quantidade de
bagaço de cana-de-açúcar gerado pelos processos de produção de etanol venha a se
tornar matéria-prima para outros processos produtivos, como a sacarificação, gerando
emprego e desenvolvimento.

CONCLUSÃO

A redução da produção de gases de efeito estufa é uma meta mundial. No
Brasil, esta pode ser obtida por meio do melhor aproveitamento de seus resíduos
agro-celulósicos. Entre as tecnologias disponíveis para este propósito, a sacarificação
destes resíduos e sua bioconversão em álcool tem sido descrita. Desta forma, pode-
se concluir que o desenvolvimento de novas linhagens bacterianas mais eficiente
neste processo, contribuem para: a) a redução do efeito estufa – devido à substituição
da gasolina por álcool (maior disponibilidade de álcool) e diminuição da queima dos
resíduos; b) possível redução no preço do álcool, arroz, milho, soja, etc – devido à
geração de renda obtida por meio da venda dos subprodutos destas indústrias; c)
redução do impacto ambiental dos resíduos da agroindústria – estes terão valor
comercial e, portanto, não serão descartados de forma inapropriada no meio ambiente;
d) desenvolvimento tecnológico regional e nacional – com tecnologia de ponta para
a obtenção dos organismos modificados, que posteriormente poderão ser utilizados
em sistemas fechados no país inteiro; e e) benefícios sociais e econômicos –
desenvolvimento de recursos humanos qualificados durante a pesquisa e
desenvolvimento; e no futuro abertura de novos postos de trabalho para implementação
da tecnologia nas indústrias.

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