AS ROTAS PARA O ETANOL CELULÓSICO NO BRASIL

Neste capítulo, propomos que a produção de etanol celulósico a partir de cana de açúcar possa ocorrer em quatro gerações. A primeira seria o que já existe, ou seja, a produção de sacarose a partir de colmo de cana de açúcar. A segunda seria a produção de etanol a partir de açúcares produzidos pela hidrólise ácida do bagaço. A terceira compreende a produção de açúcares a partir da parede celular, usando enzimas de microorganismos. A quarta geração compreenderia uma integração de todas as gerações, mas com uma matéria prima (variedades de cana) modificadas geneticamente e capazes de realizar modificações na parede celular que tornariam mais eficiente o processo da terceira geração. Para explicar como seriam estes processos, revisamos brevemente o conhecimento sobre a estrutura de polissacarídeos de parede celular e comentamos sobre a existência de genes que codificam para enzimas hidrolíticas da própria cana que poderiam ser utilizadas para a produção de etanol celulósico. A idéia de utilizar a parede celular pode ser expandida para outras espécies, como o eucalipto e sementes de árvores de espécies nativas de biomas brasileiros.


Marcos S. Buckeridge, Wanderley D. dos Santos; Amanda P. de Souza
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Salientamos também a importância de que as estratégias de produção de etanol celulósico se coadunem com processos que sejam ambientalmente corretos, como os sistemas agroflorestais. Propomos que o Brasil tem neste momento a oportunidade e deve aproveitar a chance de produzir energia renovável de forma limpa e eficiente.



Introdução

As mudanças climáticas e a elevação nos custos do petróleo aliadas às necessidades estratégicas de produção de energia têm motivado uma corrida sem precedentes à produção de combustíveis alternativos, preferencialmente de fontes renováveis. Neste cenário, o Brasil desponta como o país com as tecnologias e políticas mais avançadas do mundo devido à pioneira utilização do etanol obtido a partir da cana de açúcar como combustível, desde a década de 1970. Hoje, o Estado de São Paulo é o maior produtor de etanol no Brasil sendo, portanto, o segundo maior produtor depois dos EUA com ¼ da produção mundial de etanol.
Além da tradição, variedades altamente selecionadas, processos industriais sofisticados, clima e disponibilidade de terras agricultáveis garantem ao Brasil uma liderança confortável na tecnologia da produção de etanol. Entretanto, para preservar essa posição num cenário competitivo, o Brasil precisa manter investimentos compatíveis na geração de novas tecnologias e formação de competências. Atualmente, a conversão de material lignocelulósico ou biomassa em açúcares fermentáveis para produção de etanol vem sendo considerada como uma alternativa promissora para aumentar a produção de etanol necessária para atender à demanda mundial.
A celulose, principal componente da biomassa, é o polímero mais abundante da Terra. Ele é formado por uma cadeia linear de moléculas de glicose ligadas entre si na posição beta (β) -1,4. Tais ligações guardam energia livre e podem ser quebradas para liberar açúcares fermentáveis. Entretanto, a celulose é muito bem protegida pelas plantas, a fim de que não sejam facilmente utilizadas por predadores. Por esse motivo, o rendimento líquido da conversão da celulose em glicose livre e, a seguir, em etanol é desfavorável, com as tecnologias disponíveis. Tornar os rendimentos favoráveis possibilitará o melhor aproveitamento dessa rica matéria prima natural encontrada não só no bagaço da cana, mas em quaisquer outras fontes de biomassa vegetal (madeiras, serragens, palhadas, cascas, etc.) atualmente desperdiçadas ou utilizadas de formas menos nobres. O desenvolvimento de tecnologias capazes de desmontar a parede celular vegetal requer o aprofundamento do nosso conhecimento sobre a fisiologia e estrutura da parede celular tanto da própria cana de açúcar como de outros sistemas. Além disso, o estudo de processos enzimáticos de microorganismos que naturalmente já se alimentam da parede celular e, portanto, já possuem enzimas específicas para tal finalidade, podem nos auxiliar na utilização da energia disponível nestes polissacarídeos.




Perspectivas na Produção de Etanol Celulósico

A produção de etanol a partir da cana-de-açúcar ocorre, atualmente, pela fermentação alcoólica da sacarose. Diante das perspectivas de se obter o etanol celulósico, o etanol obtido da sacarose, assim como o obtido a partir do amido de milho, nos EUA, tem sido chamado de etanol de primeira geração. Dessa forma, o etanol celulósico produzido a partir dos polissacarídeos da parede celular vegetal é denominado etanol de segunda geração. No entanto, para a produção do etanol celulósico, prevemos diversas etapas que podem ser claramente distinguidas: 1) hidrólise química; 2) enzimática; e 3) auto-hidrólise. Por este motivo, propomos que seja chamado de etanol de segunda geração somente aquele obtido pela hidrólise química da parede celular. Esse processo utiliza solventes ácidos ou básicos para afrouxar e quebrar os polímeros da parede celular vegetal liberando mono e oligossacarídeos fermentáveis. Porém, além dos custos dos produtos químicos empregados poderá haver a produção colateral de resíduos químicos. Nossa expectativa é que a combinação de processos biológicos na hidrólise deverá render um processo ainda mais eficiente. E, por ser um processo que demanda um input maior de estudos e tecnologia para ser disponibilizado, denominamos este processo de etanol de terceira geração. Acreditamos que o maior gargalo neste processo será a produção em escala comercial de enzimas hidrolíticas e microorganismos selecionados e/ou modificados para essa finalidade. Assim, nós nos arriscamos a ir além e sugerimos o que denominamos etanol de quarta geração no qual a própria planta poderá ser modificada geneticamente para produzir as enzimas necessárias à digestão de sua própria parede celular (acima denominado auto-hidrólise) minimizando ainda mais os custos da produção (Figura 1).
Além dos métodos de hidrólise da parede, o avanço no conhecimento sobre a fisiologia de plantas utilizadas para a produção de etanol, o emprego de ferramentas de engenharia genética e industrial deverão desempenhar importantes papéis no aumento da produtividade do etanol, independentemente da geração. Mas antes de detalharmos os principais aspectos das diferentes gerações, vejamos o que é a parede celular.

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Figura 1 – Esquema das rotas propostas para obtenção do etanol celulósico.

A parede


Toda célula vegetal possui parede celular. Ela determina o tamanho e a forma da célula, confere resistência mecânica e proteção contra o ataque de predadores e patógenos, promove a adesão entre as células, delimita o tamanho e propriedades químico-físicas das moléculas que têm acesso ao interior da célula, controla o nível de umidade e ainda pode funcionar como reserva.
A parede celular é composta por uma mistura de polissacarídeos, proteínas, compostos fenólicos e sais minerais. Os polissacarídeos representam cerca de 90% do peso seco da parede e consistem em celulose, que compõe de 20-40% da parede celular, hemiceluloses (15-25%) e pectinas (~30%). Essa matriz é altamente ordenada e dinâmica podendo tornar-se mais rígida ou mais frouxa conforme as necessidades ontogênicas e comportamentais da célula ou da planta.
Seis a oito moléculas de celulose se alinham paralelamente para formar uma fibra onde ocorre a completa expulsão das moléculas de água, tornando a microfibrila extremamente longa e resistente. Sobre a superfície das microfibrilas, aderem-se as hemiceluloses (polímeros heterogêneos que são classificados de acordo com a composição em monossacarídeos) que cobrem a celulose formando o chamado domínio celulose-hemicelulose da parede celular (Figura 2). As hemiceluloses impedem que as moléculas de celulose de fibras paralelas colapsem entre si, mas também permitem a interação fraca entre uma fibra e outra, formando uma rede. O domínio celulose-hemicelulose fica imerso em um domínio formado por pectinas, que são açúcares altamente ramificados que dentre outras funções, determinam a porosidade da parede e sinalizam a presença de organismos patogênicos e insetos (Buckeridge et al. 2008).
As principais hemiceluloses encontradas em plantas são os xiloglucanos (XyG), os glucuronoarabinoxilanos (GAX) e os mananos (MN). Em todos os casos, há uma cadeia principal de monossacarídeos de glicose, xilose e manose, respectivamente, que pode ser ramificada com diferentes monossacarídeos (Figura 3). Os XyG são os mais abundantes, encontrados na maioria das eudicotiledôneas. Os GAXs ocorrem em maior proporção em paredes celulares de gramíneas (família Poaceae) e os MN são de ampla ocorrência, mas geralmente aparecem em baixa proporção, exceto em alguns grupos de samambaias (Pteridophytae) (Silva, 2005a). De fato, pode-se dizer que todas as hemiceluloses ocorrem em todas as espécies, mas em diferentes proporções. Uma exceção são os chamados glucanos de ligação mista ou β-glucanos (BG) que são compostos de uma cadeia não ramificada de glicose com ligações β -1,4, interrompida regularmente com ligações β - 1,3. Esta é uma hemicelulose que ocorre principalmente em plantas do grupo da ordem Poales (que inclui Poaceae). Porém, sabe-se que está presente também em líquens (uma associação de fungos e algas) o que indica ser possível que os genes necessários para sintetizar β-glucanos esteja presente na maioria das espécies de plantas superiores (Buckeridge et al. 2004).
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Figura 2 - Esquema da parede celular vegetal. A figura mostra a estrutura de uma microfibrila, que contém 36 moléculas de celulose depositadas umas sobre as outras. Uma das moléculas de celulose se apresenta aumentada e prolongada, mostrando as unidades de glucose ligadas entre si por ligações do tipo beta-1,4. Uma das moléculas de hemicelulose (o glucuronoarabinoxilano) também e mostrada em detalhe na parte de cima da figura.

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Figura 3 – Estrutura química das principais hemiceluloses de parede celular de plantas



Parede celular da cana-de-açúcar

A cana-de-açúcar pertence a um grupo de plantas denominadas família Poaceae (gramíneas), do qual também fazem parte o milho, sorgo, trigo e arroz. Espécies desta família apresentam uma arquitetura da parede típica que as distingue dos outros grupos vegetais. A maioria das plantas possui o xiloglucano como principal hemicelulose. Já as gramíneas apresentam como principal hemicelulose os glucuronoarabinoxilanos (GAXs) (Saavedra, Kavacsonyi & Alfoldi, 1988; Souza, 2007), embora também possua, em pequenas proporções, xiloglucanos e mananos. Além do GAXs, os β- glucanos são relativamente abundantes em todos os tecidos de cana (Silva, 2005b).
Quando examinadas ao microscópio de fluorescência, as paredes celulares de gramíneas apresentam autofluorescência (Figura 4). Este fenômeno se deve à presença de resíduos de ácido ferúlico esterificados aos resíduos de arabinose que formam a ramificação da cadeia central que, por sua vez, é composta por xilanos.
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Figura 4 – Células do parênquima do colmo de cana-de-açúcar mostrando a autofluorescência da parede celular. A seta branca mostra a parede celular.

Resíduos de ferulatos esterificados a polímeros vicinais podem sofrer dimerização, interligando os polissacarídeos entre si. A presença do ácido ferúlico confere à parede de gramíneas, especial resistência aos raios UV e ao ataque das enzimas hidrolíticas de patógenos (Figura 5).
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Figura 5 – Glucuronorabinoxilanos interligados por resíduos de ácido ferúlico esterificados a resíduos de arabinose de polissacarídeos adjacentes.


Etanol de Primeira Geração: a fermentação da sacarose
Como citado acima, o processo atual de produção de etanol a partir da cana é realizado pela extração e fermentação do caldo, que possui aproximadamente 15% de sacarose e 15% de fibras (Macedo, 2008). Antes do processo de fermentação, que ocorre por meio de linhagens selecionadas de leveduras Saccharomyces cereviseae, o caldo é esterilizado e purificado. O álcool produzido é então separado da água por destilação. Uma parte destes processos é impulsionada pela energia obtida com a queima do bagaço da cana que alimenta as caldeiras e gera eletricidade. Mesmo utilizando o bagaço para a geração de energia, a usina possui um excesso de cerca de 10% da biomassa que pode ser queimada e vendida na forma de energia elétrica (Macedo e Nogueira, 2005).
Com técnicas mais eficientes de conservação da energia produzida pela queima do bagaço esse excesso pode chegar a 45%. Além disso, cerca de 40-50% da palha da cana que hoje é mantida no campo pode ser recuperada e incorporada à biomassa (Macedo e Nogueira, 2005). Esse excesso de biomassa juntamente com os 15% de fibras poderá, no futuro, ser utilizada para produção de etanol celulósico, como detalhado a seguir.

Etanol de Segunda Geração: obtenção do etanol celulósico por hidrólise ácida

No processo de obtenção de etanol celulósico, o objetivo é “desmontar” a parede celular para utilizar os polissacarídeos como fonte de açúcares fermentáveis. No entanto, já foi salientado o quão complexa é a estrutura da parede e o quão “delicado” deve ser este processo de desmonte para preservar intactos os monossacarídeos que serão usados para fermentação. Atualmente se utiliza um processo denominado hidrólise ácida para desmontar a parede celular. Embora o processo seja funcional, ainda não é eficiente para permitir a produção comercial de etanol.
O processo básico de hidrólise ácida consiste em utilizar um ácido forte para atacar as ligações glicosídicas entre os monossacarídeos de um polissacarídeo. A Figura 7 ilustra o processo de forma simples. Os ácidos, normalmente utilizados para a obtenção de hidrólise em laboratório, são ácido sulfúrico, ácido clorídrico e o ácido trifluoroacético. Há vantagens e desvantagens em relação a cada um. Enquanto os ácidos sulfúrico e clorídrico discriminam pouco as ligações glicosídicas de diferentes tipos, atacando celulose e hemiceluloses de forma similar, o ácido trifluoroacético quebra preferencialmente as ligações mais fracas, que são as ligações do tipo alfa (α) presente nas ramificações das hemiceluloses.
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Figura 7 – diagrama da hidrólise ácida.

No caso da parede celular de cana, os glucuronoarabinoxilanos possuem ramificações de ácido glucurônico e arabinose cujas ligações são do tipo α, e estas são as primeiras a serem quebradas. Posteriormente, são quebradas as ligações β (como as β-1,4 dos xilanos). A celulose, por sua vez, é a última a ser hidrolisada devido à sua forte interação intermolecular, à completa ausência de água na estrutura da microfibrila e também ao fato das fibrilas estarem cobertas pelas hemiceluloses. O problema em um processo de hidrólise de polissacarídeos contendo ligações α e β é que como o tempo necessário para hidrólise é diferente, os monossacarideos liberados antes tendem a degradar. Este processo é chamado de caramelização (similar à formação do caramelo durante a preparação de uma calda de açúcar). Se a degradação é muito intensa formam-se furfurais que são compostos tóxicos para as leveduras que serão utilizadas na etapa de fermentação. Assim, ao hidrolisar uma mistura de celulose e hemiceluloses, a desconexão temporal das quebras das ligações glicosídicas de cada tipo de polissacarídeo torna-se um entrave para a produção de monossacarídeos fermentáveis.
Nos processos industriais, a hidrólise ácida tem sido realizada com ácido sulfúrico (H2SO4). O fato de ainda não haver comercialização de etanol produzido a partir da hidrólise ácida do bagaço da cana está relacionado a dificuldades técnicas e operacionais que resultam em um custo elevado do produto final (cerca de US$ 0,80 contra US$ 0,35 e US$ 0,27 por kg de etanol obtido a partir do amido e da sacarose, respectivamente). Parte deste custo se deve ao fato de que para que a hidrólise ocorra de forma eficiente é necessário aquecer o polissacarídeo na solução ácida. A temperatua ideal para a quebra de hemiceluloses está entre 100 a 120o C e a concentração ideal de ácido sulfúrico é ao redor de 3% (Buckeridge & Dietrich, 1990). No caso específico da cana de açúcar, este custo é minimizado devido ao fato de parte do bagaço ser queimado para alimentar as caldeiras e produzir a energia elétrica consumida no processo.
Outra dificuldade advém da necessidade de neutralização da solução contendo os açúcares para que se possa proceder à fermentação. Em geral, para a neutralização, utiliza-se hidróxido de cálcio (calcário). No entanto, ao se proceder desse modo, o ácido sulfúrico é convertido em sulfato de cálcio e não pode ser reaproveitado (Ali, Mark & Daniel, 2006). Esse é o principal fator que contribui para o alto custo da técnica. Para se obterem níveis aceitáveis de comercialização (< US$ 0,36/kg) será necessária a redução dos custos associados principalmente ao consumo e reutilização do ácido e ainda a melhora na produtividade e eficiência na conversão da biomassa (Kaylen et al., 2000; Goldenberg, 2007).
A fim de melhorar a perspectiva do uso da hidrólise ácida em escala comercial, a empresa brasileira DEDINI – Indústria de Base investiu em pesquisas para tornar a o processo mais rentável e, atualmente, possui uma usina experimental que tem utilizado o próprio etanol em mistura com o ácido sulfúrico como solvente para a lignina. Isso permite reduzir a utilização do ácido e recuperar o solvente. Outra proposta, feita por um grupo de cientistas chineses é a substituição do processo de neutralização por um processo de eletrodiálise, que consiste na aplicação de um potencial elétrico entre dois compartimentos separados por uma membrana semipermeável carregada eletricamente. Este processo permitiria uma economia de até 55% no consumo do ácido sulfúrico (Cheng et al., 2008).
Segundo Rodrigues & Guirardello (2008), os furfurais, que se formam naturalmente durante a hidrólise ácida, poderiam ser aproveitados como matéria prima na produção de solventes e resinas para fabricação de fibra de vidro e outros materiais plásticos. Sua comercialização pelas usinas poderia se tornar rentável e contribuir para reduzir o custo do etanol celulósico.
Outros pesquisadores brasileiros também têm se dedicado a buscar soluções compatíveis para melhorar o desempenho da hidrólise ácida. Em Lorena, Adriane Milagres estuda métodos de remoção química da lignina para entender seu efetivo papel na limitação da hidrólise. Em São Carlos, Paulo Seleguin e Glauco Caurin, da Escola de Engenharia de São Carlos desenvolvem um projeto de pré-processamento por despressurização explosiva do bagaço da cana. Esta técnica expõe as fibras do bagaço, aumentando a superfície de contato necessário para a quebra das microfibrilas. Estes estudos brasileiros que estão em andamento têm potencial para aumentar tanto a eficiência da hidrólise ácida quanto da hidrólise enzimática, como veremos a seguir.
Em suma, o processo de hidrólise tem um ótimo potencial para produzir açúcares fermentáveis a partir de biomassa vegetal e pode ser adaptado a diferentes casos. Para a cana, esta tecnologia já está próxima de se tornar comercial e será um ponto de extrema importância estratégica para as próximas gerações de etanol celulósico. Considerando-se o ponto em que se encontra no momento, pode-se esperar que a viabilidade comercial seja atingida em 1 a 2 anos. O desenvolvimento de tal tecnologia é de extrema importância tecnológica, pois abre o caminho para que se utilizem enzimas e/ou se modifique a matéria prima para obter rendimentos ainda maiores.

Etanol de Terceira Geração: complexidade e alternativas para a hidrólise enzimática
As maiores expectativas para a viabilização do etanol celulósico no longo prazo estão depositadas na possibilidade de utilizarmos a maquinaria bioquímica de microorganismos (fungos e bactérias) para desmontar a parede celular. O problema é que, assim como os fungos desenvolveram estratégias para invadir a parede celular, as plantas também co-evoluiram para sofisticar seus mecanismos de defesa. Assim, embora haja fungos capazes de degradar a parede celular vegetal, ela é bastante recalcitrante à degradação. Uma das formas que as gramíneas desenvolveram para resistir ao ataque enzimático parece ser a formação de interligações de ácido ferúlico entre suas hemiceluloses (dos Santos et al. 2008; Figura 5).
Em geral, a lignina, que é bastante resistente ao ataque enzimático, acumula-se apenas em certos tecidos especializados como fibras e células do tecido vascular das plantas (xilema). Entretanto, nas gramíneas, pode-se dizer que as pontes formadas pelo ácido ferúlico realizam uma quasi-lignificação em toda a extensão da parede celular, mesmo em tecidos parenquimáticos. Esse processo está relacionado à cessação do crescimento celular e resulta em uma dificuldade adicional para os microorganismos dispostos a atacar a planta. Por sua vez, certos fungos desenvolveram feruloil-esterases que são enzimas aptas a separar os resíduos fenólicos dos arabinoxilanos, tornado a parede mais susceptível às xilanases (enzimas capazes de hidrolisar xilanos).
Para chegar à celulose, que é o principal composto da parede celular, os fungos ainda precisam hidrolisar as outras hemiceluloses que recobrem as microfibrilas. Esta dificuldade é semelhante àquela dos ácidos às diferentes camadas e diferentes ligações glicosídicas. Por essa razão, fungos como os dos gêneros Trichoderma e Penicillium produzem verdadeiros arsenais com mais de uma centena de glicosidases e dezenas de celulases, quitinases, proteases e lipases, entre outras hidrolases. Evidentemente que para proceder à hidrólise enzimática da parede celular e aproveitar ao máximo a energia armazenada nestas moléculas, é pertinente estudarmos esse poderio enzimático dos fungos bem como as estruturas finas de enzimas hidrolíticas para que possamos utilizá-los em nosso favor.
Para desenvolvermos uma tecnologia eficaz para converter a parede em açúcares fermentáveis e etanol será estratégico compreender os processos relacionados com o ataque de cada enzima sobre cada ligação na parede celular.
Atualmente, dispomos de algumas informações estratégicas que podem nos ajudar a nortear o caminho do etanol celulósico:
a) conhecemos as ligações glicosídicas que têm de ser quebradas para liberar monossacarídeos (Silva, 2005b). A partir desses dados podemos iniciar um escrutínio sistemático e detalhado de enzimas e métodos para obter uma completa hidrólise desses monossacarídeos.
b) conhecemos parte da identidade de 469 genes da cana de açúcar que estão relacionados ao metabolismo de síntese e degradação da parede celular na cana de açúcar (Lima et al., 2001). Entre estes genes estão vários que são capazes de degradar a parede celular. Essa informação nos indica que se obtivermos o controle desses genes poderíamos ativá-los no momento desejado.
c) há um grande número de estudos com enzimas de microorganismos mostrando como estas atacam polissacarídeos de parede celular. Neste caso, há dois caminhos que devem ser tomados paralelamente. Um deles é a prospecção de espécies mais eficientes. O outro é a transformação genética de fungos que produzam maior quantidade de enzima ou então que expressem genes que codifiquem para enzimas heterólogas de interesse.
d) Temos algum conhecimento sobre a estrutura de glicosidases de parede celular que nos possibilitam desenhar estratégias para melhorar o desempenho destas enzimas ao nosso favor.
Estes quatro conjuntos de informações são fundamentais para a concepção de uma estratégia para obtermos um etanol de terceira geração que inclua o bagaço da cana-de-açúcar e como uma das matérias primas com eficiência energética e, sobretudo, sustentabilidade, tanto em relação aos gases estufa, quanto em relação aos demais dejetos poluentes.
Outro desafio que se impõe à obtenção do etanol a partir da celulose é o da fermentação de pentoses. As hemiceluloses são ricas em pentoses como xiloses e arabinoses. O Saccharomyces cereviseae, microorganismo usualmente empregado na produção de álcool a partir da sacarose, é muito pouco eficiente na conversão de pentoses. A presença de pentoses de fato inibe a fermentação das hexoses. Uma perspectiva é a utilização de outras espécies de fungos, melhor adaptados às pentoses. Espécies como Pachysolen tannophilus são capazes de utilizar xilose e fermentam parcialmente outras pentoses depois de consumirem a glicose e a celobiose disponíveis que são seus alimentos preferidos (Hinman et al. 1989).
Para desenvolver as tecnologias do etanol celulósico é conveniente cruzar estas informações e coordenar esforços com base em prioridades dos estudos. A tecnologia deverá incluir o desenvolvimento de maquinário e processos para produção de enzimas em escala industrial, bem como dos processos de degradação da parede em si, mas também as tecnologias voltadas ao desenvolvimento das variedades de cana apropriadas e as tecnologias para preparar o bagaço para incubação.
Prospecção, seleção e engenharia de fungos
A prospecção e a seleção de fungos é uma das estratégias para obter melhores enzimas para hidrolizar o material lignocelulósico. Em um país como o Brasil, que tem alto nível de biodiversidade, existe maior probabilidade de encontrar microorganismos que apresentem novidades nesse aspecto.
Estudos feitos na Índia com palhada de cana, indicam que os fungos Aspergillus terreus, Cellulomonas uda, Trichoderma reesei e Zymomonas mobilis podem ser “chaves” na degradação do material lignocelulósico (Singh et al., 2008). No Brasil, o grupo de pesquisa liderado por Maria de Lourdes Polizeli da USP Ribeirão Preto está empenhado na prospecção de fungos e na caracterização, imunolocalização e purificação de enzimas fúngicas. Um dos estudos mostra a caracterização de uma xilanase de Aspergillus (Rizzati et al., 2008). Nosso grupo, no Departamento de Botânica - IB/USP prospectou a atividade celulolítica de mais de 50 espécies de fungos do solo do cerrado e trabalha na viabilização do Penicillium steckii para uso industrial (não publicado). Nosso grupo também estudou a ação da celulase sobre xiloglucanos polímero também presente no colmo da cana. Descobrimos, por exemplo, que celulases de Trichoderma podem funcionar como um sistema de restrição análogo às enzimas de restrição usadas sobre o DNA (Tiné et al., 2003) agindo sobre a estrutura química fina dos polissacarídeos hemicelulósicos (ver também Tiné et al., 2006). Informações detalhadas sobre o mecanismo da ação enzimática sobre polisacarídeos são valiosas se desejamos induzir um aumento na eficiência dessas hidrolases.
Outro grupo de pesquisa brasileiro que tem trabalhado com hidrolases fúngicas e sua ação sobre polissacarídeos de parede celular é o de Edivaldo Ximenes Ferreira Filho, da Universidade de Brasília. Seus estudos estão focados na detecção e caracterização das enzimas, assim como nos genes que as codificam (ver Iembo et al. 2006 e Salles et al., 2007 como exemplos).
Na USP Zona Leste, Felipe Chambergo, estuda a utilização da potente maquinaria de expressão gênica de celulases de Trichoderma reesei a fim de sintetizar celulases de interesse para a indústria. Nesse âmbito (engenharia genética de fungos), já existem resultados bastante interessantes sobre a regulação e sinalização da expressão gênica obtidos pela equipe de Gustavo Goldman da USP Ribeirão Preto. Este grupo verificou que a espécie Aspergillus niger, por exemplo, tem um único fator de transcrição (XLnR) que regula a expressão de todos os genes relacionados à degradação de polissacarídeos, enquanto que em Trichoderma, ocorre mais de um fator de transcrição para estes mesmos genes (Gustavo Goldman, comunicação pessoal). Goldman pretende manipular os mecanismos de regulação da expressão gênica, a fim de obter mutantes capazes de produzir continuamente enzimas celulolíticas na presença de substratos, sem que o sistema de expressão gênica sofra retro-inibição pelos produtos da ação enzimática, como ocorre naturalmente.
Caracterização e engenharia de enzimas
Outro tipo de retro-inibição ou inibição pelo produto ocorre no nível da catálise. Quando a concentração de produtos se torna alta no meio, as enzimas não conseguem se desligar do produto formado e, então, a atividade enzimática começa a cair. A atividade pode não só parar completamente, como pode até mesmo se inverter. No Instituto de Química da USP, Sandro Marana está propondo a união de um domínio de ligação à celulose (CBD – cellular binding domain) a β-glicosidases a fim de promover a redução da concentração local dos produtos da atividade da enzima. O CBD é uma seqüência protéica encontrada em algumas celulases que adere à microfibrila provocando uma desorganização local na estrutura cristalina da fibra que facilita a catálise. Um “braço” protéico posiciona o sítio catalítico no local exato onde a desordenação promovida pelo CBD expõe as moléculas de celulose ao ataque enzimático. Um recurso importante na pesquisa interessada na compreensão e engenharia de enzimas é o do desvendamento da estrutura terciária de proteínas. O grupo de Marana acredita que a razão produto/substrato é menor nas proximidades do polissacarídeo. Com foco na estrutura das enzimas, o grupo de Marana estuda β-glicosidases ativas sobre celobiose (um dímero de glicose produzido pela hidrólise da celulose) e sobre celodextrinas (oligossacarídeos beta-1,4 ligados derivados da celulose). Eles estão interessados nos aminoácidos localizados fora do sítio ativo da enzima e que estão associados à especificidade da ação enzimática. O grupo trabalha com uma metodologia denominada evolução dirigida em que são produzidas pequenas variações na seqüência de aminoácidos das enzimas e a seguir são realizados ensaios a fim de selecionar variantes cuja eficiência catalítica de interesse aumentou e então são estudadas quais as variações estruturais responsáveis pelo aumento na atividade/especificidade.
As diferentes glicosidases são agrupadas em famílias. Entretanto, a grande maioria das delas ainda não tem sua estrutura terciária desvendada ou tem apenas uns poucos representantes cuja estrutura estérica foi elucidada. O grupo de Igor Polikarpov da USP de São Carlos estuda a estrutura terciária de enzimas por cristalografia de raios X e entre elas glicosidases. Eles já conseguiram cristalizar e resolver a estrutura de xilanases de Trichoderma reesei (Galubev et al. 2000, Rojas et al. 2005). Polikarpov e seus colaboradores são responsáveis por técnicas que têm levado ao aperfeiçoamento da cristalografia que tornou a metodologia muito mais eficiente. Eles estão empenhados na criação/aperfeiçoamento de modelos de enovelamento protéico que possam ser usados para prever a estrutura terciária com base na seqüência de aminoácidos e que podem ser utilizados na engenharia de catalisadores enzimáticos.
Usando conhecimentos sobre os mecanismos fisiológicos, bioquímicos e moleculares para aprimorar o acesso à celulose
Ainda que a estrutura básica das hemiceluloses já seja conhecida (tipos e proporções entre as ligações glicosídicas), é necessário estudarmos sua “estrutura fina”. Para tanto é necessário utilizar enzimas específicas que revelem os padrões de ramificação e/ou das repetições das ligações glicosídidas na cadeia principal (proporções entre ligações beta-1,3 e beta-1,4 nos beta-glucanos e entre as manoses e glicoses nos mananos, etc). Tais informações são relevantes, pois temos verificado que a ação das hemicelulases depende fortemente da estrutura fina (Tiné et al. 2003). Além das estruturas baseadas nos açúcares, outro aspecto ainda relativamente pouco estudado em relação às hemiceluloses são as ramificações com radicais acetila e também com compostos fenólicos (dos Santos et al. 2008b). Para que possamos aprofundar nosso conhecimento a esse respeito precisamos utilizar estudos com base em enzimas específicas puras e espectrometria de massas (e.g. MS-MS).
Para que possamos manipular as enzimas corretas para desmontar a parede e obter acesso à celulose precisamos também aprofundar nosso conhecimento sobre os mecanismos de sinalização e expressão dos genes relacionados à parede celular.
Atualmente, nosso grupo está estudando a composição e estrutura fina da parede celular em diversos órgãos da cana de açúcar e as variações nessa composição durante o desenvolvimento. Investigamos a importância dos compostos fenólicos na recalcitrância da parede celular ao ataque de hidrolases (dos Santos et al. 2008c) e o controle hormonal sobre o crescimento, o desenvolvimento e a composição da parede celular. Estamos estudando ainda os mecanismos de autodigestão da parede que ocorrem naturalmente (como em frutos e sementes) e que podem auxiliar na compreensão do processo de síntese e, sobretudo, de degradação da parede. Estamos também empenhados em estudar as enzimas e a composição da parede celular de sementes visando à produção de álcool através do uso sustentável de sementes nativas. Sementes de espécies nativas de vários biomas brasileiros, entre eles a Mata Atlântica e do Cerrado, acumulam grandes quantidades de polissacarídeos de parede celular (Buckeridge & Dietrich, 1990, Buckeridge et al. 1995, Mayworm et al. 2000). Em algumas destas o acúmulo é de tal ordem que é possível extrair carboidratos em larga escala para uso industrial. Já desenvolvemos, por exemplo, um processo para obter galactomanano a partir de sementes de faveiro (Dimorphandra mollis; Panegassi et al. 2000). Durante os últimos 15 anos temos desvendado os mecanismos bioquímicos e fisiológicos envolvidos nos processos de degradação desses polímeros. Purificamos diversas enzimas (Buckeridge et al. 2000) e clonamos genes relacionados (ver Alcântara et al. 1999, 2006, Lisboa et al. 2006 e Brandão 2008), bem como investigamos os mecanismos de controle hormonal da degradação da parede celular nesses modelos de estudo (Santos et al. 2004, Tonini et al. 2006).
A idéia é introduzir em leveduras os genes que codificam para as enzimas de hidrólise de galactomananos e xiloglucanos de sementes de Leguminosae. Então, poderíamos usar as leveduras para degradar o polissacarídeo das sementes para produzir monossacarídeos e, a seguir, promover a fermentação alcoólica. Além do faveiro (Dimorphandra mollisii) o feijão-do-mato (Sesbania virgata) e o jatobá (Hymenaea courbaril) produzem grandes quantidades (acima de 40% do peso seco) de polissacarídeos nas sementes (Buckeridge et al. 2000). Nos casos citados, as espécies são de larga ocorrência em vários biomas sul-americanos e é possível a exploração sustentada através de contatos com cooperativas que já utilizam outras partes de forma sustentável.
Em termos de escala de produção, a quantidade de etanol passível de ser produzida é relativamente pequena em relação ao que a cana-de-açúcar pode produzir. No entanto, as vantagens ambientais suplantam muito às econômicas no caso de se formar sistemas agro-florestais em que florestas sejam regeneradas (ou mantidas) em meio ao canavial. Esta estratégia, que denominamos ‘caminho do meio’ (Buckeridge, 2007), tem o potencial de produzir um etanol que poderia ser certificado como ambientalmente correto e poderia assegurar fatias de mercado (por exemplo, na Europa e Japão) de combustível que tenha padrão de produção com baixo impacto ambiental.
No caso da cana-de-açúcar, uma possibilidade é fazer um “screening” das paredes celulares das diversas variedades buscando diferenças de composição que possam nos auxiliar a compreender as variações estruturais e produzir mutantes que permitam maior acesso à celulose.
Como o grande propulsor da busca por novas tecnologias para obtenção de etanol é a mudança climática global, nosso grupo também estuda os efeitos das mudanças climáticas sobre a cana-de-açúcar e outras espécies de interesse para a obtenção de energia renovável em regiões amazônicas, como a Senna reticulata (mata-pasto) e Euterpe oleracea (açaí). Um dos objetivos é entender os mecanismos de acúmulo de biomassa e avaliar outros aspectos bioquímicos e ecofisiológicos afetados por mudanças climáticas.
Plantas de cana-de-açúcar incubadas em atmosfera de gás carbônico de 720 ppm (concentração esperada para 2050, caso as emissões de combustíveis fosseis continuem na mesma taxa), apresentaram um aumento na taxa fotossintética e um grande aumento em biomassa. Na cana, o aumento pode chegar a 60% apenas na biomassa do colmo (Souza et al. 2008). Nestas plantas, observamos a superexpressão dos genes relacionados com expansão celular como a xiloglucano endo-transglicosilase (XTH), com a fotossíntese e também com a inibição da expressão de genes relacionados à síntese de fenilpropanóides (intermediários na síntese da lignina). Paralelamente, o grupo de Gláucia Souza do IQ USP, com o qual colaboramos, observou que plantas com alta produtividade de açúcares expressam a XTH com maior intensidade e também têm inibida expressão da cinamil orto-metiltransferase (COMT), relacionada à síntese de fenilpropanóides.
Neste momento estamos aprofundando os estudos sobre o papel da enzima XTH no metabolismo de parede celular de cana e o processo fotossintético em cana-de-açúcar. Nossa expectativa é a de poder aumentar a produtividade da cana aumentando a expressão dos genes de fotossíntese que respondem ao CO2 elevado. Com isto, a planta não só produz mais sacarose, mas também mais fibra, que servirá como substrato para a produção do etanol celulósico.

Etanol de Quarta Geração: a planta ajudando na produção de etanol
O que chamamos de etanol de quarta geração irá integrar os processos de produção das demais gerações (Figura 1). Consistirá em um conjunto de alterações na própria planta de cana-de-açúcar (adaptável também a outras espécies) que deverão aumentar a eficiência dos processos de produção de etanol de segunda e terceira gerações.
Além de otimizar a produção do etanol através de modificações na planta e microorganismos utilizados na degradação da celulose, uma alternativa que poderá reduzir o custo da produção de enzimas é a modificação da cana para expressar enzimas capazes de promover a digestão da parede celular. Nosso grupo se dedica a entender tanto a relação entre a expressão dos genes relacionados à biossíntese e degradação da parede celular quanto àqueles relacionados com o metabolismo de carboidratos em geral. Em 2001, nosso grupo participou do projeto SUCEST da cana e encontrou 459 genes relacionados ao metabolismo de parede celular (Lima et al. 2001). Neste trabalho foi demonstrado que grande parte dos genes da via de biossíntese está ativada, enquanto os genes da via de degradação em geral não são expressos durante o desenvolvimento. Isso indica que deve haver um baixo turnover de polissacarídeos da parede. No entanto, os genes existem e devem ser expressos em condições específicas como durante a senescência foliar. Se obtivéssemos controle sobre estes genes poderíamos induzir a planta a expressar estas enzimas na época da colheita, reduzindo a necessidade de se introduzir enzimas fúngicas para desmontar a parede.
Outra idéia é a de introduzir na cana genes heterólogos que sejam ativos apenas em condições específicas, durante o processamento da biomassa. Já foram produzidas plantas transgênicas, nas quais foi inserido o gene da α-amilase que converte o amido em glicose e uma celulase para a degradação da celulose. Num outro estudo, uma endoglucanase E1 de Acidothermus cellulolyticus que funciona otimamente a 81o C e pH 5 foi expressa no apoplasto de várias plantas incluindo Arabidopsis e arroz. A enzima mostrou-se ativada em extratos brutos e quando adicionada aos colmos de arroz após a colheita e após um pré-tratamento ácido, mas não causou degradação da celulose in planta (Dai et al, 2000). Estudos em andamento em nosso laboratório indicam que a presença de hemicelulose e lignina previnem o acesso da E1 à celulose (dos Santos et al. 2008c). Sendo assim, torna-se necessário estudar in vitro a ação de enzimas que degradam lignina como lacases e peroxidases, bem como enzimas ativas sobre hemiceluloses (feuloil-esterases, xilanases, liquenases, etc). Posteriormente, a expressão dessas enzimas pode ser estudada em Arabidopsis e cana, direcionando-as para compartimentos celulares que permitam que sua ação seja disparada apenas no momento desejado. Para tanto, precisamos prospectar as enzimas produzidas pela plantas de interesse e/ou relacionadas, assim como os mecanismos de sinalização envolvidos na regulação da expressão desses genes. Dessa forma estaríamos aptos a tentar controlar esses mecanismos de sinalização em nosso favor. Já prevendo esta possibilidade, nosso grupo, em colaboração com outros, está realizando experimentos para verificar quais enzimas, em quanto tempo, e em qual ordem e proporções, devem ser utilizadas a fim de degradar a parede da cana-de-açúcar com a maior eficiência possível.
Uma outra possibilidade é modificar o tipo de hemicelulose presente na parede e ativar a síntese dos polissacarídeos reduzindo a quantidade de lignina a fim de produzir a “cana-energia” que, como conseqüência da maior quantidade de polissacarídeos, possuirá mais energia conversível em etanol. Essa planta poderá ser usada para hidrólise com coquetéis enzimáticos de alta eficiência ou mesmo por fungos geneticamente modificados ou ainda por enzimas expressas pela própria planta.
Apesar do alto grau de conhecimento que necessitamos ter para que se torne possível tal situação, a manipulação e/ou introdução de genes para a degradação da parede in vivo é possível. Acreditamos que o etanol de quarta geração se tornará viável em cerca de 10 anos, pela utilização de modificações genéticas que alterem a parede celular e fisiologia da planta de forma a prepará-la para melhor adaptação a diferentes condições com aquelas advindas das mudanças climáticas globais.
Para que esta quarta geração de etanol seja realizada, metas como o seqüenciamento completo do genoma da cana e alguns fungos-chave, o mapeamento dos genes de parede, a compreensão dos mecanismos de controle fisiológico (hormônios, fatores de transcrição), bem como na compreensão da relação entre estrutura e eficiência de enzimas e substratos, devem se tornar linhas de pesquisa prioritárias, hoje.
A Figura 7 resume as rotas do etanol celulósico integradas entre si, considerando a possibilidade de se alterar, com tecnologias de quarta geração, o balanço entre biossíntese e degradação e produzir plantas que tenham mais celulose e, portanto, um maior nível de empacotamento de energia nas ligações glicosídicas (veja Buckeridge 2007 para maiores detalhes).
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Figura 7 – Rotas possíveis para o etanol de quarta geração.

Abordagens paralelas à cana-de-açúcar para o avanço tecnológico do etanol celulósico
O eucalipto é atualmente a maior fonte de celulose disponível comercialmente, embora sua produção esteja voltada para a fabricação de papel. Entretanto, a casca do eucalipto, atualmente desperdiçada, é uma grande fonte de carboidratos que podem vir a ser matéria-prima para produção de etanol celulósico. Há alguns anos, nosso grupo realizou um levantamento sobre a composição da parede celular do eucalipto em um projeto financiado pela Suzano Papel e Celulose e, atualmente, o grupo liderado por Carlos Labate da ESALQ/USP vem realizando um estudo sobre produtividade e composição dos carboidratos da casca de diferentes variedades de eucalipto. Algumas têm a casca especialmente rica em hexoses chegando a apresentar até 5% de sacarose em sua composição. Labate também está interessado em estudar celulases com especificidade por essas matérias-primas, como as encontradas no trato digestivo de cupins e outros insetos especializados em madeiras. Além do conhecimento sobre a composição da parede de eucalipto, a polpa também já foi estudada com relação ao ataque de enzimas fúngicas (Medeiros et al., 2002).
Outro resíduo que pode ser obtido em grandes quantidades é o ingáço (pendúculo do cacho) de banana com composição similar à da cana (resultados não publicados) que podem ser digeridos por enzimas de fungos (Medeiros et al. 2000). Outro resíduo promissor é a borra de café, que é rica em manano e celulose (não publicado) que poderia ser digerida por uma mistura de mananases (Lisboa et al., 2006) e celulases. Há várias outras possibilidades, mas estes processos podem ser vistos como exemplos que poderiam complementar a produção de etanol celulósico com base no bagaço da cana.
Mesmo com o foco no etanol de alta tecnologia, é importante não perdermos a necessária atenção sobre a fisiologia das plantas de interesse para produção de etanol. Precisamos investir em plantas mais produtivas e precoces a fim de reduzir a necessidade de expansão das áreas de plantio. Do mesmo modo, é importante obtermos variedades mais resistentes à seca, alagamento, frio e patógenos para fazer frente as modificações climáticas em curso, bem como para atender à demanda por variedades aptas ao cultivo em regiões distintas das tradicionais.

Conclusões

O etanol celulósico, ao lado do biodiesel, é uma promissora fonte de combustível sustentável e eficiente capaz de atender à demanda universal por combustíveis líquidos, tanto para propelir veículos quanto para alimentar as iminentes células de combustível. Diversos métodos para obtenção de etanol estão em experimentação e é imprescindível que o Brasil mantenha sua liderança natural neste campo para que o valor tecnológico agregado dos biocombustíveis possa ser revertido em nosso favor enquanto o produto avança para se tornar uma comódite. Neste caminho, a cana de açúcar desponta com larga vantagem como a planta sobre a qual devemos depositar nossos maiores esforços a curto prazo. Entretanto, não podemos perder de vista outras fontes de lignocelulose como o eucalipto e outras plantas tais como o sorgo sacarino e as sementes de espécies nativas. Também devemos manter a atenção sobre tecnologias voltadas à hidrólise, mas sem perder de vista a necessidade avançar na produtividade das plantas que servirão como matéria-prima a este processo.
Além disso, independentemente do foco em combustíveis de segunda, terceira e quarta gerações é importante que conheçamos profundamente a fisiologia das plantas de interesse para produção de etanol. Assim, poderemos produzir variedades mais resistentes à seca, alagamento, frio e patógenos, bem como plantas mais produtivas e precoces frente a modificações no ambiente de plantio devido à possibilidade de expansão de áreas e às mudanças climáticas em curso no planeta.
A produção de bioenergia é uma medida de extrema importância para enfrentarmos os sérios desafios ambientais relacionados com os efeitos das mudanças climáticas globais. Ainda que a bioenergia não seja a única solução para este problema, ela certamente contribuirá para mitigar as emissões de combustíveis fósseis.
Outro desafio igualmente importante é a preservação da biodiversidade. O aumento de produtividade esperado nos próximos 10 a 15 anos, deve ser usado para diminuir a necessidade de expansão da área plantada para produzir combustível. Ao mesmo tempo, deve ser incentivada a recuperação de florestas que, se possível, podem ocupar espaço em meio aos canaviais, recuperar as matas ciliares e trazer de volta parte da biodiversidade.
A produção de etanol celulósico com alta eficiência e sustentabilidade não será tarefa de poucos, mas resultará da integração entre diversos grupos de pesquisa especializados em diferentes áreas da fisiologia, ecologia, bioquímica, genética, enzimologia, física e engenharia, entre outras. O Brasil está diante de mudança no modo de produção rara ou talvez inédita na história. Podemos desenvolver uma tecnologia de alto valor agregado e ao mesmo tempo usá-la também para recuperar a biodiversidade, integrando sustentabilidade e desenvolvimento tecnológico. Talvez não seja exagero dizer que Brasil tem a chance de liderar uma transição entre o velho Homo sapiens pujante e poluidor para um novo e equilibrado Homo ambientalis.

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