"MELHORAMENTO GENÉTICO E MAPEAMENTO DA CANA-DE-AÇÚCAR"

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A cana-de-açúcar é uma espécie vegetal de grande importância para a agriculta brasileira e mundial. Segundo Daniels e Roach (1987), trata-se de uma espécie alógama, da família Gramíneae (Poaceae) tribo Andropogoneae, gênero Saccharum. Dentro do gênero Saccharum, ocorrem principalmente seis espécies: S. officinarum L. (2n = 80), S. robustum Brandes e Jeswiet ex Grassl (2n = 60-205), S. barberi Jeswiet (2n = 81-124), S. sinense Roxb. (2n = 111-120), S.spontaneum L. (2n = 40-128), e S. edule Hassk. (2n = 60-80). Como genomas de todas essas espécies podem estar participando de alguma forma dos cultivares modernos, considera-se que a cana-de-açúcar é uma das espécies cultivadas de maior complexidade genética.

Anete Pereira de Souza, Antonio Augusto Franco Garcia e Karine Miranda Oliveira

1. MELHORAMENTO GENÉTICO

INTRODUÇÃO

Diversos artigos, dissertações, teses e livros apresentam em detalhes como tem sido feito o melhoramento genético da cana-de-açúcar no Brazil e no mundo. Como exemplo podem ser citados Stevenson (1965), Blackburn (1983), Berding e Roach (1987), Berding and Skinner (1987), Breaux (1987), Heinz e Tew (1987), Hogarth (1987), Tew (1987), Machado Jr et al. (1987), Matsuoka e Arizono (1987), Peixoto (1986), Matsuoka (1988), Bressiani (1993; 2001), Arizono (1994; 1999), Pires (1993), Landell e Alvarez (1993), Machado Jr (1993), Matsuoka et al. (1999a; 1999b) e Landell e Bressiani (2008), dentre uma extensa lista. Nos itens relacionados ao melhoramento, que serão apresentados a seguir, apresentaremos os principais aspectos abordados nesses textos, sendo que nossas principais referências foram os textos de Matsuoka et al. (1999a; 1999b), cuja consulta recomendamos para maiores detalhes.

BREVE HISTÓRICO SOBRE O MELHORAMENTO NO BRASIL

Matsuoka et al. (1999a) apresentam em detalhes como se iniciou o melhoramento no Brasil, a partir do século XIX. Resumidamente, os autores mencionam que os primeiros relatos de que as sementes (e não os colmos) de cana-de-açúcar poderiam originar descendentes foi feito em Barbados, em 1858 (Deerr, 1921; Stevenson, 1965). Porém, assume-se que o melhoramento iniciou-se efetivamente em 1885, em Java, a partir da germinação de sementes de S. Spontaneum. No Brasil, entretanto, em 1842, o médico Gervásio Caetano Peixoto Lima (Peixoto Lima, 1842) afirmou numa defesa de tese que a cana-de-açúcar se reproduzia a partir de sementes sexuais. Esse fato, aliado a vários outros, parece indicar que o Brasil figura entre os pioneiros na obtenção de novas variedades de valor comercial a partir de sementes.

A partir do início do século XX, houve aumento da preocupação com a baixa produtividade dos canaviais, bem como com o aumento das pragas (Deerr, 1921; Aguirre Jr, 1936; Edgerton, 1955; Dantas, 1960; Stevenson, 1965; Andrade, 1985). Em função disso, passou a haver intenso intercâmbio de germoplasma entre vários países, sendo os proprietários de engenhos os principais responsáveis por isso (Matsuoka et al. 1999a). No entanto, em momentos em que os produtores se sentiam pressionados por crises no setor, houve iniciativas para a criação de estações experimentais (GERAN, 1971).

Atualmente, o Brasil possui 4 programas de melhoramento da cana-de-açúcar principais: 1) Programa Cana do Instituto Agronômico de Campinas, iniciado em 1933; 2) Programa de Melhoramento Genético da Cana-de-açúcar da RIDESA (Rede Interuniversitária para o Desenvolvimento do Setor Sucroalcooleiro), formado por Universidades Federais e com início em 1971 como PLANALSUCAR; 3) Centro de Tecnologia Canavieira (CTC), que iniciou seus trabalhos em 1968 (como COPERSUCAR); 4) CanaVialis, que iniciou suas atividades em março de 2003.

MÉTODOS DE MELHORAMENTO

Apesar de existirem grandes diferenças nos detalhes sobre como os programas de melhoramento do Brasil (e do mundo) conduzem suas atividades, há alguns pontos em comum que serão aqui destacados. Em essência, o melhoramento baseia-se na seleção e clonagem de genótipos superiores presentes em populações segregantes, que são obtidas através de cruzamentos sexuais entre indivíduos diferentes. O sucesso desses processos depende de vários fatores, dentre os quais a escolha adequada dos genitores de forma a maximizar a chance de obter ganhos com a seleção, a instalação de experimentos com boa precisão experimental, a escolha correta dos caracteres e épocas de avaliação. A maioria das características consideradas na seleção são de natureza quantitativa e controladas por muitos locos (QTL's), tais como teor de sólidos solúveis, teor de sacarose, diâmetro e número de colmos, teor de fibras, resistência ao acamamento e florescimento, precocidade, resistência a pragas e doenças, etc.

Anualmente, os programas de melhoramento geram populações segregantes formadas de milhares de plântulas, as quais serão posteriormente submetidas à seleção. O número de plântulas (ou seedlings) varia de acordo com o programa, e depende de fatores técnicos e econômicos. Essas populações segregantes são então submetidas à seleção em diferentes esquemas, que são apresentados a seguir.

i) Geração de variabilidade para efetuar seleção

A variabilidade genética disponível para seleção provém de cruzamentos sexuais e pode ser realizada de diferentes maneiras (Matsuoka et al., 1999a; 1999b): a) cruzamentos biparentais, onde cruzamentos são feitos usando dois genitores conhecidos, podendo algum deles ser usado exclusivamente como fêmea; b) policruzamentos, quando um grande número de genótipos é intercruzado; nesse caso, colhe-se sementes nas panículas de todos genitores envolvidos, o que impede a identificação da fonte de pólen; c) polinização livre, onde sementes são colhidas em plantas crescendo livremente.

Em termos genéticos, os cruzamentos devem ser planejados de tal maneira que seja maximizada a probabilidade de seleção de genótipos que podem ser liberados como cultivares comerciais. Para tanto, uma alternativa bastante usada consiste em se escolher como genitores materiais com boa performance para características de interesse econômico (Matsuoka et al., 1999a), o que evidentemente ocorre para os cultivares usados comercialmente. Vale ressaltar que isso pode levar a um estreitamento da base genética (Lima et al., 2001).

Uma vez que a cana-de-açúcar é uma espécie alógama, os cruzamentos devem ser planejados de forma a evitar a ocorrência de cruzamentos entre indivíduos aparentados. Isso pode ser conseguido com base nas genealogias dos materiais, bem como na divergência genética obtida com marcadores moleculares (Lima et al., 2001). Outros critérios, como complementariedade dos caracteres, capacidade de combinação dos materiais em cruzamentos, capacidade de cada material de gerar boas populações ao longo do tempo, também devem ser empregados.

Alguns autores mencionam que o coeficiente de herdabilidade no sentido restrito, que leva em consideração a fase sexual, também pode ser considerado no planejamento de cruzamentos, uma vez que indicam como os caracteres de interesse são transmitidos aos descendentes. Alguns resultados indicam que a ação gênica predominante no teor de Brix é a aditiva, sendo que para os demais componentes de produção é a não aditiva (Hogarth, 1980; Wu et al., 1980). Hogarth (1977) cita que, para produção de colmos, a variância dominante tem se mostrado de mesma magnitude que a aditiva, sendo a variância epistática predominante para peso de colmos. Hogarth (1987) apresentou valores elevados de herdabilidade para o caráter teor de fibra. Já para volume e número de colmos, a variância dominante mostrou-se importante (Hogarth et al., 1981). Bressiani (1993) reportou valores elevados de herdabilidade para comprimento dos colmos e Brix, nas condições brasileiras. Para ferrugem, a herdabilidade tem se mostrado elevada (Bressiani e Sanguino, 1994; Hogarth et al., 1983; Sordi et al., 1988), o que também geralmente acontece com outras doenças (Matsuoka et al., 1999a), indicando que a seleção de genitores resistentes pode ser efetiva. Entretanto, vale mencionar que há exemplos de segregação transgressiva, com o surgimento de progênies resistentes mesmo em cruzamentos feitos entre genitores suscetíveis (por exemplo, como reportado por Arizono, 1994).

ii) Etapas iniciais de seleção

Também nesse etapa há muitas variações sobre como os programas de melhoramento a conduzem, principalmente com relação as taxas de seleção, tamanhos de parcela, número de locais e repetições (Simmonds, 1979; Skinner et al., 1987; Matsuoka et al., 1999a). De forma geral considera-se: a) seleção com baixa intensidade em etapas iniciais, realizando-a apenas para os caracteres de alta herdabilidade, b) aumento da intensidade de seleção à medida que a precisão experimental aumenta, c) recomendação de cultivo apenas quando houver muitos resultados experimentais, em diferentes locais e anos de cultivo.

A herdabilidade no sentido amplo, que deve ser levada em consideração nessas etapas, apresenta vários valores diferentes reportados na literatura. Por exemplo, com relação ao vigor, alguns trabalhos a mencionam como baixa, muito embora vários programas de melhoramento tenham obtido ganhos com a seleção intensa para essa característica (Skinner et al., 1987). Esses autores reportam vários valores de herdabilidade para diversas características, como por exemplo produção de canas por hectare, produção de brix por hectare, número e diâmetro de colmos, bem como resistência a carvão e ferrugem. Matsuoka et al. (1999a) comentam que esses resultados parecem indicar que, nas fases iniciais, a seleção é mais efetiva para Brix e resistência a carvão e ferrugem, devendo os resultados ser interpretados com cautela dado o baixo número de estimativas disponíveis.

Outra característica muito importante a ser considerada nessas fases é a capacidade de rebrota dos genótipos. Apesar do pequeno número de estimativas disponíveis a esse respeito, muitos programas a consideram na seleção (Watkins, 1967; Giamalva et al., 1967; Giroday, 1977; Mariotti, 1977; Bond, 1978; Skinner et al., 1987; Arizono, 1994; Matsuoka et al., 1999a), o que pode levar ao descarte de muitos genótipos nessas etapas iniciais.

Várias estratégias para seleção nesse etapas têm sido empregadas e serão brevemente descritas a seguir.

Plantio em “bunch”: Segundo Ladd et al. (1974), é um método recomendado quando se dispõe de um grande número de indivíduos de um cruzamento não testado previamente, uma vez que permite na mesma área a avaliação de muitos colmos simultaneamente. Consiste no plantio das plântulas em molhos formados por 5 a 10 delas (Mangelsdorf, 1953), esperando-se que a seleção natural elimine as inferiores, pela competição (Urata, 1970), embora isso pareça questionável, uma vez que não se sabe se esse efeito pode de fato ocorrer nesses bunchs heterogêneos. Matsuoka et al. (1999a) apontam como principais desvantagens a) a impossibilidade de selecionar mais de um colmo por molho, já que a mistura impede identificações individuais; b) a impossibilidade de avaliar o perfilhamento, que é correlacionado positivamente com a capacidade de brotação e a produção. Skinner et al. (1987) afirmam que há exemplos de sucesso obtido com seu emprego, muito embora não existam dados conclusivos a respeito de sua superioridade.

Seleção de famílias: Baseia-se no fato que, para os caracteres importantes, a herdabilidade entre famílias é superior à herdabilidade entre plantas individuais. Em função disso, vários programas de melhoramento preferem então realizar selecionar entre as famílias, escolhendo as que possuem médias fenotípicas superiores. Nota-se que que tal procedimento também serve para identificar cruzamentos superiores (Skinner et al., 1987). Matsuoka et al. (1999a) mencionam que tal procedimento pode levar ao descarte de indivíduos superiores presentes em famílias com baixa média, mas com elevada variância.

Seleção de plantas individuais: Muitos programas de melhoramento realizam esse tipo de seleção, usando como critério nessa etapa apenas os caracteres de alta herdabilidade, tais como Brix e resistência ao florescimento e as doenças. Latter (1964) menciona que em alguns casos tal estratégia de seleção pode levar a melhores resultados que a seleção entre famílias, e também reduzindo o risco de descartar indivíduos superiores em famílias com baixa média. Matsuoka et al. (1999a) mencionam que deve-se verificar a viabilidade econômica de se avaliar cada planta individualmente, em detrimento da avaliação de um número elevado de plântulas. Skinner et al. (1987) e Matsuoka et al. (1999a) citam que, na prática, as avaliações individuais normalmente são possíveis, já que nessas etapas iniciais muitos genótipos serão descartados visualmente apenas com base no seu vigor.

iii) Avaliações de clones em experimentos com repetições

Nessa etapa, os genótipos selecionados em (ii) são comparados com base em experimentos usando delineamentos estatísticos apropriados. Em função do elevado número de genótipos sob avaliação e do reduzido número de colmos para instalar experimentos maiores, normalmente as parcelas são pequenas (p. ex., uma linha com 5 m de comprimento), em apenas uma repetição, local e época de avaliação. É muito comum usar nessa etapa os blocos casualizados completos aumentados (Federer, 1956). Outros caracteres que não foram avaliados na etapa anterior são agora considerados, e comumente são feitas também avaliações da capacidade de rebrota. Matusuoka et al. (1999a) citam que em função da reduzida precisão experimental, os valores de herdabilidade ainda são baixos e portanto a seleção não deve ser muito intensa. Muitos programas de melhoramento de cana-de-açúcar do mundo tem aplicado intensidades por volta de 10 a 30% (Skinner et al., 1987), mas tais valores não podem ser generalizados.

iv) Ensaios de competição

Os clones selecionados em (iii) são então avaliados em experimentos com muitas repetições e locais de avaliação, e também ao longo de vários cortes. No Brasil, usualmente tais experimentos são instalados segundo o delineamento em blocos ao acaso. Quando a precisão experimental permitir razoável segurança nas recomendações, após avaliações por vários cortes, ambientes e anos de cultivo, finalmente os novos cultivares podem ser usados comercialmente. Uma característica interessante dessa fase é que há grande envolvimento do setor produtivo, sendo os experimentos instalados em Usinas e avaliados em condições muito próximas das que serão encontradas na prática.

2. MAPEAMENTO GENÉTICO

INTRODUÇÃO

Os caracteres agronômicos de importância econômica, que são selecionados nos programas de melhoramento genético, são em sua grande maioria resultado da ação conjunta de vários genes, e portanto sofrem grande influência do ambiente. O termo QTL (quantitative trait loci) tem sido utilizado para nomear as regiões cromossômicas que contêm genes (ou locos) que controlam esses caracteres poligênicos (Falconer e MacKay, 1996).

Com o recente advento dos marcadores moleculares, tornou-se possível estudar com maior facilidade esses QTLs (regiões). Os marcadores moleculares são uma ferramenta rápida e eficaz para estudos genômicos, uma vez que detectam o polimorfismo diretamente ao nível do DNA e não sofrem qualquer tipo de influência ambiental (Souza, 2001). Com base nesse polimorfismo, é possível fazer inferências sobre as relações entre o genótipo e o fenótipo dos indivíduos, o que em última análise permite aumentar a eficiência dos programas de melhoramento.

Mapear QTL´s significa fazer inferências em todo o genoma sobre as relações entre o genótipo (avaliado com base nos marcadores moleculares) e o fenótipo (avaliações em experimentos apropriados) de caracteres quantitativos. Essas inferências incluem informações sobre número, posição, efeitos, interações dos alelos dos QTL´s dentro dos locos (dominância) e entre os locos (epistasia), efeitos pleiotrópicos dos QTL´s e interações entre QTL´s e ambientes (Zeng, 2001). Para tanto, é necessária uma população que apresente variabilidade genética e elevado desequilíbrio de ligação. Nessa população, é construído inicialmente um mapa de ligação (ou mapa genético), que serve de base para a futura localização dos QTL's. Para tanto, são necessárias metodologias genético-estatísticas sofisticadas, com forte suporte computacional, devido à complexidade das análises.

MAPAS GENÉTICOS

A maioria dos delineamentos genéticos usados para construção dos mapas genéticos de ligação utiliza populações provenientes do cruzamento entre linhagens endogâmicas (por exemplo, usando retrocruzamentos ou autofecundações). Os métodos genético-estatísticos, nesse caso, já estão estabelecidos e implementados em diversos softwares, como por exemplo o MAPMAKER/EXP. No entanto, para a cana-de-açúcar, a obtenção de tais linhagens é impraticável, principalmente em função da grande depressão por endogamia que ocorre quando ocorrem autofecundações. Nesse caso, as populações de mapeamento são gerações F1's obtidas a partir de cruzamentos entre indivíduos não endogâmicos (Lin et al., 2003).

Para a cana-de-açúcar (e várias outras espécies para as quais não há linhagens endogâmicas disponíveis, como por exemplo o maracujá e o eucalipto), uma alternativa que foi muito utilizada no passado para a construção de mapas genéticos (e para o mapeamento de QTL´s), é denominada duplo pseudo-testcross. Essa estratégia consiste na construção de dois mapas individuais (um para cada parental), através da identificação de polimorfismos em marcadores de dosagem única para cada parental (Grattapaglia e Sederoff, 1994; Shepherd et al., 2003; Porceddu et al., 2002; Carlier et al., 2004). Com base nessa abordagem, mapas de ligação para S. officinarum (‘LA Purple’) e S. robustum (‘Mol 5829’) foram construídos usando marcadores RAPD, RFLP e AFLP em dose simples (Guimarães et al., 1999). Outras situações também foram consideradas, porém raramente o tipo de cruzamento usado envolveu genitores comerciais (Sobral e Honeycutt, 1993; Al-Janabi et al., 1993; da Silva et al., 1993; da Silva et al., 1995; Grivet et al., 1996; Hoarau et al., 2001). Entretanto, tanto do ponto de vista biológico como estatístico, é desejável a integração das informações contidas nesses mapas individuais em um único mapa integrado. Isso só pode ser feito com a presença de marcadores em heterozigose em ambos parentais, que são utilizados para estabelecer relações de ligação entre os marcadores segregando individualmente em cada parental (Barreneche et al., 1998; Wu et al., 2000; Garcia et al., 2006; Oliveira et al., 2007).

A construção de mapas genéticos integrados, com a utilização de diferentes tipos de marcadores moleculares com diferentes segregações, apresenta grandes vantagens, pois permite aumentar a saturação do mapa de ligação e estender a caracterização da variação polimórfica em todo o genoma. Especificamente para espécies poliplóides, como a cana-de-açúcar, marcadores codominantes podem ser úteis para reunir os grupos de co-segregação em seus respectivos grupos de homologia (da Silva et al., 1993; Grivet et al., 1996). Além disso, a localização de QTL´s com maior precisão é facilitada com a disponibilidade de uma mapa genético integrado (Maliepaard et al., 1997). Entretanto, em parentais heterozigotos para cada loco segregante, podem existir diferentes números de alelos, o que torna mais complicada a análise de ligação, uma vez que as fases de ligação nos parentais podem ser desconhecidas a priori, dificultando a detecção dos eventos de recombinação (Maliepaard et al. , 1997; Wu et al., 2002).

Wu et al. (2002) propuseram um método genético-estatístico, baseado em análises de máxima verossimilhança, que permite estimar simultaneamente a fração de recombinação e as fases de ligação entre locos em populações de mapeamento provenientes do cruzamento entre indivíduos não endogâmicos (geração F1). Tal método possibilita a construção de um mapa genético integrado, que é resultante da combinação de diversas informações geradas por diferentes tipos de marcadores moleculares, cujo conteúdo de informação é variável. Essa abordagem foi utilizada por Garcia et al. (2006) e Oliveira et al. (2007), que construíram mapas genéticos integrados, composto por 357 marcadores distribuídos ao longo de 131 grupos de co-segregação, a partir do cruzamento entre dois cultivares pré-comerciais de cana-de-açúcar (SP80-180 x SP80-4966). Esses resultados foram superiores aos obtidos quando os mesmos dados foram analisados utilizando o programa JoinMap, o que indica, neste caso, a maior eficiência na estimativa de ligação e fases de ligação do método proposto por Wu et al. (2002). Para tanto, foi utilizado um software chamado OneMap, desenvolvido especificamente para esse fim (Margarido et al. 2007), mas que também pode ser usado em outras espécies.

Apesar da grande superioridade dessa novas abordagem de análise em relação aos métodos anteriores, no caso da cana-de-açúcar ainda só é possível utilizar marcadores com segregações 1:1 e 3:1, que sabidamente são menos informativos que outros tipos (como por exemplo os que segregam 1:2:1 ou 1:1:1:1, no caso de espécies diplóides). Isso dificulta a obtenção dos grupos de ligação e a ordenação dos marcadores dentro desses grupos, resultando em mapas menos saturados e com menor cobertura do genoma. Além disso, a integração dos mapas dos genitores nem sempre é possível.

MARCADORES MOLECULARES

Os marcadores moleculares são ferramentas valiosas no estudo de genomas complexos como o da cana-de-açúcar (Daugrois et al 1996). A incorporação destes na seleção de características econômicas durante os primeiros estágios de melhoramento, assim como, na escolha de melhores parentais em um cruzamento, pode reduzir significativamente o tempo de desenvolvimento de novas variedades. Estes objetivos podem ser alcançados com sucesso com a disponibilidade de marcadores polimórficos robustos que co-segregam com características agrícolas economicamente importantes.

Um importante progresso no conhecimento da estrutura genômica e na genética dos cultivares modernos de cana-de-açúcar tem sido alcançado nas últimas décadas graças ao emprego de marcadores moleculares. As informações coletadas sobre a diversidade entre cultivares (Lu et al 1994a; Jannoo et al 1999a; Lima et al., 2002), espécies parentais (Glaszmann et al 1990; Burnquist et al 1992; D’Hont et al 1993; Lu et al 1994b; Jannoo et al 1999a; Nair et al 1999) e outros gêneros do complexo Saccharum (Al-Janabi et al 1994b; Besse et al 1996, 1997; Alix et al 1998, 1999) ajudam os melhoristas a refinarem as estratégias gerais para a exploração dos germoplasmas existentes. Os marcadores podem ser também utilizados para identificar os cultivares, para controlar a progênie e monitorar introgressão (D’Hont et al 1995; Harvey et al 1998; Cordeiro et al 2000; Piperidis et al 2001). No entanto, muito deve ser feito antes que a seleção assistida de marcadores para características agronômicas quantitativas possa ser aplicada.

A seleção assistida por marcadores (SAM) fundamenta-se no conceito de que é possível inferir a presença de um gene a partir de um marcador fortemente ligado a este. Quando o marcador se encontra muito longe da região de interesse, a possibilidade de ambos serem transmitidos aos indivíduos da progênie é reduzida devido aos eventos de recombinação. Sendo assim, a existência de uma forte ligação entre a característica de interesse e o marcador é pré-requisito neste tipo de seleção (Kumar et al. 1999). A construção de um mapa de QTL’s (Quantitative Trait Loci) requer a elaboração preliminar de um mapa de locos marcadores, o qual fornece a estrutura física para a alocação dos QTL’s (Bearzoti 2000).

Os microssatélites ou SSRs (Simple Sequence Repeat) tornaram-se amplamente empregados nos estudos de marcadores de plantas. Estes marcadores, convencionalmente, são repetições em tandem de pequenas seqüências de nucleotídeos contendo uma a seis bases de comprimento. A variação no número de repetições resulta em locos polimórficos que são extremamente úteis, principalmente, em estudos de mapeamento. O polimorfismo dos marcadores SSRs é revelado pela reação em cadeia da polimerase (PCR) através da amplificação do DNA genômico total utilizando dois primers únicos compostos de seqüências curtas de nucleotídeos que flanqueiam e, portanto, definem o loco SSR. Estes marcadores são geralmente utilizados para mapeamento genético, fingerprinting, estudos populacionais e evolutivos, tanto para plantas como para animais (Bell e Ecker 1994; Yang et al. 1994; Senior et al. 1996; Russel et al. 1997; Petren et al. 1999).

O valor dos SSRs, como marcadores, é atribuído a sua natureza multialélica, herança codominante e transferibilidade entre espécies (Griffiths et al. 2002; Decroocq et al. 2003; Eujayl et al. 2004), facilidade de detecção pela PCR, abundância relativa e cobertura extensiva do genoma (Li et al. 2002) e necessidade de quantidades pequenas de DNA para dar início às reações (Powell et al. 1996). Os SSRs exibem também altas taxas de mutação (Vigoroux et al. 2002) e associação preferencial com regiões não-repetitivas do genoma (Morgante et al. 2002). Evidências substanciais sugerem que o tipo de motivo, comprimento e mutação dependem da localização dos SSRs (Morgante et al. 2002).

A habilidade dos SSRs em revelar alta diversidade alélica é particularmente proveitosa na discriminação entre os genótipos. O sucesso do uso deste marcador em outras espécies, como, cevada (Saghai et al. 1994; Russel et al. 1997), arroz (Wu e Tanksley 1993), trigo (Röder et al. 1995), maçã (Szewc-McFadden et al. 1996) e abacate (Lavi et al. 1994), estimularam a aplicação desta técnica para espécies mais geneticamente complexas, como a cana-de-açúcar (Cordeiro et al. 2000).

Análises prévias de todos os possíveis motivos de SSRs, em bancos contendo seqüências de plantas, revelaram freqüências variando a cada 29kb à 50kb, dependendo da espécie (Lagergrantz et al. 1993; Morgante e Olivieri 1993). A frequência de SSRs em plantas foi avaliada também por hibridização de primers, sugerindo uma variação de um SSR a cada 65kb a 80kb (Panaud et al. 1996; Eght e Maymarquardt 1997).

Os métodos convencionais de desenvolvimento de SSRs baseiam-se no isolamento e sequenciamento de clones contendo possíveis motivos SSRs, seguidos de desenho de primers para as regiões flanqueadoras dos motivos. Buscando a redução do custo e do tempo gasto, foram desenvolvidos processos de clonagem para criação de bibliotecas enriquecidas com SSRs (Edwards et al. 1996), no entanto, o desenvolvimento de marcadores SSR genômicos permaneceu ainda laborioso. A busca de SSRs em sequências expressas depositadas em bancos de dados públicos é uma estratégia alternativa, mais simples, rápida e econômica, no desenvolvimento dos SSRs.

A análise de ESTs (Expressed Sequence Tags) é uma estratégia simples para o estudo da porção expressa do genoma, mesmo em organismos com genomas grandes, complexos e altamente redundantes, como a cana-de-açúcar. A estratégia básica para a obtenção de EST constitui um método rápido e eficiente de amostragem do genoma para seqüências ativas de genes. O EST ou etiqueta de seqüência expressa representa uma seqüência parcial do cDNA de um gene que foi expresso em um tecido, num determinado momento (Sterky e Lundeberg 2000). Estudos da distribuição dos SSRs nos ESTs (EST-SSRs) foram realizados tanto em genomas eucariotos (Cardle et al. 2000; Kantety et al. 2002) quanto em procariotos (Gur-Arie et al. 2000).

Existem inúmeras vantagens na utilização de sequências expressas como marcadores genéticos, em relação a seqüências anônimas de DNA: (1) se o marcador EST estiver geneticamente associado a uma característica de interesse, é provável que o mesmo afete diretamente a característica (Cato et al. 2001; Chen et al. 2001; Thiel et al. 2003). Desta forma os marcadores derivados dos ESTs oferecem oportunidades para descoberta de genes; (2) os marcadores EST são provavelmente mais altamente conservados, logo, mais transferíveis entre espécies que sequências derivadas de marcadores anônimos (Cordeiro et al. 2001; Taylor et al. 2001; Decroocq et al. 2003). Como os marcadores derivados de ESTs encontram-se em regiões transcritas do genoma, os sítios de primers são mais conservados, tornando-os mais transferíveis entre espécies e aumentando seu valor em programas de melhoramento (Fraser et al. 2004); (3) os ESTs que apresentam homologia com genes candidatos podem ser utilizados de forma específica para o mapeamento genético e são úteis no alinhamento de genomas entre espécies relacionadas para análise comparativa (Holton et al. 2002). Além disso, os microssatélites derivados de EST (EST-SSR) ocorrem em alta frequência no genoma (Kantety et al. 2002), sendo a frequência estimada maior nas sequências codificadoras que nas regiões não codificadoras (Temnykh et al. 2001; Morgante et al. 2002).

No entanto, como marcadores genéticos, os EST-SSRs têm sido avaliados em vários estudos e tendem a ser consideravelmente menos polimórficos que os marcadores gerados a partir de sequências genômicas para arroz (Cho et al. 2000), cana-de-açúcar (Cordeiro et al. 2001) , trigo (Eujayl et al. 2001), cevada (Thiel et al. 2003).

Uma vez que os EST-SSRs amostram diretamente a variação nas regiões transcritas do genoma, podem prover estimativa da diversidade funcional. A instabilidade no número de repetições de SSRs implicaram na herança e severidade de algumas doenças humanas (Brook et al. 1992; Vincent et al. 2000). A variação similar no número de repetições em plantas pode indicar variação em características vegetativas e de frutos, aumentando seus valores na seleção assistida por marcadores (Fraser et al. 2004).

A ocorrência de SSRs em sequências EST tem sido reportada em diversas espécies de planta, incluindo arroz (Sasaki et al. 1994; Yamamoto e Sasaki 1997; Cho et al. 2000), uva (Scott et al. 2000), cevada (Holton et al. 2002; Thiel et al. 2003), milho (Wang et al. 1998; Sharapova et al. 2002), trigo (Eujayl et al. 2001; Kantety et al. 2002; Gupta et al. 2003; Gao et al. 2004; Nicot et al. 2004; Yu et al. 2004), algodão (Saha et al. 2003; Qureshi et al. 2004; Han et al. 2006) e laranja (Chen et al. 2006). A geração dos EST-SSRs tornou-se um atrativo complemento para as coleções existentes de SSRs.

Em cana-de-açúcar, a análise de 8.678 seqüências ESTs revelou aproximadamente 250 SSRs, a maioria composta por repetições perfeitas de trinucleotídeos sendo os motivos (CCG)n, (CGT)n e (CCT)n os mais comuns (Cordeiro et al., 2001). Todos os EST-SSRs selecionados foram polimórficos nos gêneros correlatos Sorgo e Erianthus. O menor valor, para o conteúdo de informação de polimorfismo (PIC), foi obtido entre as variedades de cana-de-açúcar (0,23), aumentando entre as espécies S. officinarum e S. spontaneum (0,62) e, alcançando o maior valor (0,80) entre os gêneros Sorgo e Erianthus. Em virtude da base genética estreita das variedades de cana-de-açúcar, a utilização de EST-SSR pode auxiliar na caracterização da variabilidade genética disponível nas coleções de germoplasmas de gêneros correlatos utilizados em programas de introgressão. Desta forma, a limitação da introgressão do genoma Erianthus em cana-de-açúcar (Saccharum) pode ser superada pela utilização de EST-SSR na identificação da porção do genoma Erianthus nos híbridos intergenéricos (Cordeiro et al. 2001).

A aplicação dos ESTs mostrou-se um meio eficiente e bem sucedido de identificação de genes em cana-de-açúcar. Um estudo realizado por Carson e Botha (2000) revelou que de todos os clones de cDNA da bainha foliar, identificados na busca de homologia, 38% apresentaram similaridade significativa com seqüências de genes conhecidos. Este valor pode ser comparado ao observado na análise de bibliotecas de cDNA do endosperma e semente de milho (39.3%, Shen et al. 1994), sendo ainda melhor que os resultados obtidos utilizando bibliotecas de cDNA das folhas de milho (20%, Keith et al. 1993), tecidos de diferentes estágios de crescimento em arroz (25%, Yamamoto e Sasaki 1997) e porções de RNA de sementes estioladas, raiz, folhas e inflorescências de Arabidopsis (32%, Newman et al. 1994).

Várias razões têm sido apresentadas para os diversos resultados obtidos entre os diferentes projetos EST. Por exemplo, Van de Loo e colaboradores (1995) indicaram valores de identificação mais altos quando o tecido utilizado na construção da biblioteca de cDNA era especializado em processos envolvendo classes de proteínas bem caracterizadas. Em adição, mostrou-se que o sequenciamento da extremidade 5’, em vez da extremidade 3’, é mais informativo, e conseqüentemente a utilização de bibliotecas de clones direcionados fornecerá resultados mais significantes (Shen et al. 1994).

Projetos visando o sequenciamento de seqüências expressas têm sido desenvolvidos para diferentes espécies, com o intuito de fornecer informações básicas para o melhor entendimento da biologia das espécies e aprimoramento de programas de melhoramento, identificando uma grande coleção de novos genes candidatos. O número de sequências expressas depositadas no GenBank para trigo, milho, arroz e soja corresponde, respectivamente, a 416.000, 197.000, 113.000 e 308.000 sequências. Para cana-de-açúcar, projetos foram iniciados na África do Sul (Carson e Botha 2000), na Austrália (Casu et al. 2001) e no Brasil (http://sucest.lad.ic.unicamp.br/en). Na Austrália, o projeto está focado principalmente no mapeamento genético e na aplicação de marcadores genéticos no melhoramento genético da cana-de-açúcar, enquanto que a África do Sul está conduzindo um projeto pequeno (<500 ESTs). Uma busca mais recente de ESTs derivados do meristema apical, das folhas e colmos de cana-de-açúcar após a indução de floração (Ma et al. 2004) representam uma fonte adicional de ESTs, resultando numa combinação mundial total de 255.135 ESTs derivados de cana-de-açúcar (Casu et al. 2005).

As informações geradas nestes projetos têm sido utilizadas no mapeamento comparativo da família das Gramíneas, empregando-se marcadores comuns que hibridizam com cana-de-açúcar, arroz, milho, trigo hexaplóide, cevada e sorgo. No entanto, a informação molecular desenvolvida até o momento para a cana-de-açúcar é mínima comparada com a informação necessária para identificação e caracterização de locos que codificam características de importância agronômica.

O SUCEST (Brazilian Sugarcane EST Project), do programa Genoma da FAPESP, corresponde ao mais completo banco de dados de ESTs de cana-de-açúcar. Cerca de 200 pesquisadores de diversas universidades e centros de pesquisas do estado de São Paulo e outros lugares do Brasil contribuíram na construção deste banco de dados. Objetivando a obtenção de uma exaustiva visão do transcriptoma da cana-de-açúcar, 26 bibliotecas de cDNA foram construídas a partir de vários órgãos e tecidos de pelos menos 12 cultivares, em diferentes estágios de desenvolvimento. Destas bibliotecas, um total de 237.954 sequências ESTs foram obtidas, agrupadas em 43.141 prováveis transcritos únicos de cana-de-açúcar. Baseados na estimativa de redundância interna, concluiu-se que a coleção destes transcritos, possivelmente, indica cerca de 33.000 genes de cana-de-açúcar (Grivet et al. 2001; Grivet et al. 2003; Vettore et al. 2003). A anotação funcional destes produtos baseou-se na similaridade com sequências conhecidas do GenBank (Vettore et al. 2003).

Este banco representa uma ótima fonte de marcadores candidatos (Camargo 2000), que podem representar genes de importância econômica, em especial, aqueles relacionados ao metabolismo de sacarose, à resistência a pragas e doenças e à tolerância a condições adversas de clima e de solo (FAPESP 2001), podendo ser diretamente utilizados em programas de mapeamento genético. Uma vez mapeados estes marcadores podem ser avaliados para associação com as características de importância agronômica, bem como empregados na seleção assistida por marcadores, já que podem ser os genes responsáveis pela característica.

MAPEAMENTO DE QTL's

Da mesma forma que para os mapas de ligação, no caso dos QTL's também existem diversos métodos genético-estatísticos disponíveis para análise de dados no caso de populações provenientes de linhagens endogâmicas. Podem ser citados: a) Análises para cada marca individualmente, baseadas em testes estatísticos como o teste t, análise de variância, regressão linear simples (Lynch e Walsh, 1998; Edwards et al., 1987; Stuber et al., 1987) e teste da razão de verossimilhanças (Weller, 1986); b) Mapeamento por Intervalo (IM, Lander e Botstein 1989); c) Mapeamento por Intervalo Composto (CIM, Zeng 1993, 1994; Jansen e Stam 1994); d) Mapeamento de Múltiplos Intervalos (MIM, Kao e Zeng, 1997; Kao et al., 1999). Esses métodos estão implementados em softwares como o QTLCartographer (Basten et al 1999). Do ponto de vista teórico, há diversas vantagens dos modelos MIM sobre os demais (Zeng et al., 1999). Esses modelos fornecem resultados úteis para o melhoramento, permitindo por exemplo a obtenção dos valores genéticos (breeding values) de cada indivíduo para uso na seleção assistida por marcadores. No caso da cana-de-açúcar, muitos trabalhos de mapeamento de QTL’s foram desenvolvidos utilizando análise de marcas individuais, ou ainda Mapeamento por Intervalo (por exemplo, Grivet et al., 1996; Guimarães, 1999; Hoarau et al., 2001; Ming et al., 2001, 2002; Kido, 2003), geralmente considerando os mapas genéticos de cada genitor separadamente. Dentre os resultados obtidos, destacam-se a identificação de uma sonda RFLP em ligação a um gene para resistência a ferrugem que apresentava segregação 3 (resistente): 1 (susceptível) na progênie (Grivet et al., 1996). Guimarães (1999) detectou uma sonda RFLP associada com florescimento em cana-de-açúcar. Ming et al. (2001, 2002), ao considerarem mapeamento de QTL’s para conteúdo de açúcar, detectaram 36 QTL’s para produção de açúcar, peso em colmo, número de colmo, conteúdo em fibras e cinzas. Recentemente, em estudo de mapeamento de QTL’s para diversas características agronômicas, em cruzamentos de duas espécies brasileiras de cana-de-açúcar foram detectados 11 QTL’s para Brix, 9 para diâmetro dos colmos, 7 para número de perfilhos, 21 para altura de colmos, 6 para conteúdo de fibras, 2 para percentagem de açúcar (POL) e 3 QTL’s para produtividade (Kido, 2003). Dada a importância econômica da cultura e os problemas a ela associados, torna-se evidente os avanços que podem ser alcançados no melhoramento genético da cana-de-açúcar com o mapeamento de QTL’s.

Em populações provenientes do cruzamento entre indivíduos não endogâmicos, como é o caso da cana-de-açúcar, há uma complicação adicional para o mapeamento de QTL's: as fases de ligação entre diferentes locos e QTL´s não são conhecidas a priori. Isso dificulta as análises de ligação e o mapeamento de QTL´s nesses casos. Lin et al. (2003) apresentaram um método genético-estatístico de mapeamento por intervalo que permite, simultaneamente, estimar ligação e fase de ligação entre locos de marcadores e QTL´s em populações F1, considerando todos os tipos de marcadores (informativos e parcialmente informativos). Contudo, esse modelo não foi desenvolvido para espécies poliplóides, como a cana-de-açúcar, e tem como principal limitação o fato de não haver controle da variação causada por QTL’s fora do intervalo em estudo. Neste caso, a existência destas regiões adjacentes tende a influenciar as análises, levando à detecção de falsos positivos. Para situações em que há QTL’s ligados em um mesmo cromossomo, os resultados tornam-se viesados, pois os respectivos efeitos dos QTL's não podem ser isolados (Zeng, 1994). Isto resulta em redução do poder do teste estatístico e, além disso, a epistasia não pode ser diretamente incluída no modelo. Há ainda outros pontos que devem ser considerados no mapeamento de QTL’s de cana-de-açúcar de forma que os resultados sejam realmente úteis ao melhoramento genético. A cana-de-açúcar é uma espécie perene, em que vários cortes são conduzidos, de modo que os indivíduos ficam sujeitos a diferentes condições ambientais ao longo dos anos, e é importante identificar QTL’s que se expressem de forma consistente ao longo desses cortes. Isto permitiria a obtenção de melhores estimativas dos valores genéticos dos indivíduos, fornecendo uma importante informação que poderia ser canalizada para programas de seleção assistida, de maneira a auxiliar os programas de melhoramento. Outro ponto é o estudo da correlação entre caracteres, também de importância para o melhoramento genético. No melhoramento, geralmente são feitas seleções para vários caracteres simultaneamente. Claramente, o mapeamento deveria levar isso em consideração, pois informações a respeito da base genética dos caracteres correlacionados (pleiotropia e ligação entre QTL’s) podem auxiliar o melhorista no processo de seleção.

Para se estudar adequadamente a correlação entre caracteres e a interação entre QTL’s e ambientes nessas populações, é desejável que sejam desenvolvidos modelos de análise considerando múltiplos caracteres e ambientes, algo que ainda não foi desenvolvido para espécies como a cana-de-açúcar. Acredita-se que os resultados obtidos por esses novos modelos possam permitir a obtenção de melhores estimativas do valor genotípico dos indivíduos, o que é extremamente importante no contexto da seleção assistida por marcadores.

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