Processo para obtenção de Etanol a partir do Amido

O objetivo deste trabalho foi estudar diferentes estratégias de processo utilizando a cepa recombinante de Saccharomyces cerevisiae L36-w4, visando favorecer a produção de etanol a partir do amido de farinha de mandioca. O meio de cultura utilizado foi constituído de xarope de farinha de mandioca e nutrientes específicos. Foram realizados 3 ensaios em biorreator: ensaio descontínuo padrão (150g ART/L) em anaerobiose com uma dextrinização prévia da farinha por 10min/85ºC, ensaio descontínuo alimentado com aeração até 10h de cultivo e posterior alimentação com xarope de farinha de mandioca (dextrinização prévia por 10min/85ºC) para iniciar a fase fermentativa e um ensaio descontínuo utilizando meio à base de xarope de farinha obtido por uma etapa prévia de dextrinização de 1h/85ºC. Os resultados mostraram que a condição que maximiza a produtividade em etanol está relacionada com uma maior dextrinização do amido, maior concentração celular e alta atividade enzimática no início do processo fermentativo.



Estratégias de Processo para obtenção de Etanol a partir do Amido pela Levedura Recombinante L36w4

Patrícia Helena R. Costa1, Lana Zanetti Tavares1, Maria Cândida R. Facciotti1, Antonio M.F.L.J. Bonomi2, Ileana S. Rubió3, Ana Clara G. Schenberg3.

1 Escola Politécnica da USP - Departamento de Engenharia Química - São Paulo – SP
2Instituto de Pesquisas Tecnológicas do Estado de São Paulo –AB/IPT
3Instituto de Ciências Biomédicas da USP - Laboratório de Genética de Microrganismos

Introdução

A busca por uma correta matriz energética tem sido um dos principais desafios enfrentados pelos países interessados em diminuir a dependência do petróleo e de seus derivados e cumprir as medidas estabelecidas pelo Protocolo de Kyoto, de diminuir a emissão de gases causadores do efeito estufa que afeta todo o planeta (Carvalho, 2002; Salvi, 2002). Dessa forma, muitos estudos estão sendo desenvolvidos, no sentido de se obter um combustível menos poluente, a partir de matérias-primas renováveis. Entre as alternativas apresentadas atualmente está o uso do hidrogênio e do biodiesel. No entanto, essas tecnologias encontram-se em fase de desenvolvimento (Silveira, 2003). Outra alternativa, talvez a mais viável até o momento, é o uso do etanol, que tem sua tecnologia bastante desenvolvida, sendo o Brasil maior detentor da tecnologia de produção de etanol a partir da cana-de-açúcar. Além da sacarose da cana-de-açúcar, outra fonte de carboidratos utilizada em alguns países como Estados Unidos e França na produção de etanol é o amido (Montesino e Navarro, 2000). O amido é considerado uma das fontes mais abundantes de carboidratos na natureza. No entanto, a levedura Saccharomyces cerevisiae, de uso consagrado na produção industrial de etanol, não é capaz de converter o amido diretamente a etanol, sendo necessárias usualmente duas etapas prévias para a conversão do amido em açúcares fermentescíveis: liquefação ou dextrinização com a enzima α-amilase e sacarificação com a glicoamilase (Nakamura, 1996; Kondo, 2002). Segundo Verma et al.(1999) a adição de enzimas ao processo aumenta de forma considerável o custo do processo. Dessa forma, a obtenção de uma linhagem recombinante de Saccharomyces cerevisiae, capaz de converter o amido em etanol em uma única etapa, é de grande interesse tanto do ponto de vista econômico como tecnológico (Guedes, 1995). Pesquisadores do Laboratório de Genética de Microrganismos do Instituto de Ciências Biomédicas da USP em conjunto com o Laboratório de Biologia Molecular da Universidade de Brasília, obtiveram uma linhagem recombinante estável de S. cerevisiae capaz converter o amido em etanol em uma única etapa, denominada S cerevisiae L36-w4, portadora do gene da a-amilase de Bacillus subtilis e de múltiplas cópias do gene da glicoamilase de Aspergillus awamori. O objetivo deste trabalho foi estudar diferentes estratégias de processo utilizando a cepa L36-w4, visando otimizar a produção de etanol a partir do amido da farinha de mandioca.
Material e Métodos
Microrganismo: Foi utilizada uma linhagem amilolítica recombinante de Saccharomyces cerevisiae, denominada L36-w4, portadora do gene da a-amilase de Bacillus subtilis, do gene da maltase de Saccharomyces cerevisiae e do gene da glicoamilase de Aspergillus awamori, inserido no cromossomo em múltiplas cópias (Rubió, 1996). A cultura foi preservada em tubos contendo meio sólido YPDA ágar (10g/l de extrato de levedura; 20 g/L de glicose; 20 g/L de peptona; 20 g/L de ágar e 5 g/L de amido), sob refrigeração e repicada a cada três meses. Para a inoculação dos fermentadores, a cepa foi pré-cultivada em incubador rotativo em frascos de 1L contendo 350 mL de meio líquido YPD (10 g/L de extrato de levedura, 20 g/L de peptona e 20 g/L de glicose) a uma temperatura de 30 °C e freqüência de agitação de 200 rpm durante 8 horas. Uma fração do inóculo correspondente a 14% do volume útil do fermentador foi adicionada no início dos cultivos descontínuos realizados em fermentador.
Meios de cultura: O meio de cultura utilizado para os cultivos descontínuos foi preparado utilizando farinha de mandioca como a principal fonte de carbono, com uma concentração inicial de polissacarídeos de 150 g/L de ART (ART = açúcares redutores totais) complementados com os seguintes nutrientes: extrato de levedura- 0,5 g/L; NaH2PO4.H2O – 1,0 g/L; MgSO4.7H2O – 0,25 g/L e (NH4)2SO4 – 4,5 g/L. As condições de cultivo fixadas foram: temperatura de 30 °C, pH 4,5 e freqüência de agitação igual a 300 rpm. O ensaio descontínuo alimentado foi realizado partindo-se de um volume inicial de 6 litros com uma concentração inicial de 20 g/L de ART e complementado com os nutrientes nas seguintes concentrações: extrato de levedura- 0,83g/L; NaH2PO4.H2O – 1,67 g/L; MgSO4.7H2O – 0,42 g/L e (NH4)2SO4 – 7,5 g/L, de maneira que no volume final após a alimentação, se obtivessem as mesmas concentrações do ensaio descontínuo padrão. A alimentação foi realizada a uma vazão constante de 0,2 L/h, utilizando-se xarope de farinha de mandioca concentrado. O volume de xarope alimentado (cerca de 4,5 L) foi calculado de acordo com a concentração de ART do xarope, de forma que, ao final do processo, a massa de ART adicionada ao reator fosse igual à massa total adicionada no ensaio descontínuo padrão.
No preparo do xarope, foi adicionado à farinha de mandioca, 0,3g/L da enzima a-amilase (Novo Nordisk A/S–BAN 800mg/AD202260), de maneira a propiciar uma dextrinização parcial do amido como descrito em Guedes (1995), empregando-se diferentes tempos de pré-hidrólise (tabela1).
Foram realizados dois ensaios descontínuos (DP e DP1), visando verificar como o tempo de liquefação do amido com a-amilase, poderia influenciar na produtividade em etanol. Adicionalmente, foi realizado um ensaio descontínuo alimentado (DA) com uma fase inicial aerada, visando favorecer o crescimento celular e aumentar a produção de glicoamilase, de forma a verificar a influência destes dois fatores na produtividade em etanol. A tabela a seguir (tabela 1) mostra as condições dos ensaios realizados.
Tabela 1 - Condições dos ensaios realizados com a cepa L36-w4.
EnsaiosDA
(descontínuo alimentado)
DP
(descontínuo padrão)
DP1
(descontínuo 1)
Meio de culturaAmido dextrinizado 10min/85ºCAmido dextrinizado 10min/85ºCAmido dextrinizado 60min/85ºC
Concentração inicial de ART (g/L)150150150
Fração de inóculo empregada (%)141414
Volume útil do equipamento (L)101010
Temperatura (°C)303030
pH4,54,54,5
Agitação (rpm)300300300
Aeração (vvm)Até 10h de cultivo, 0,2 vvmnãonão
Duração (h)666666

Metodologia Analítica: Amostras foram retiradas do fermentador e analisadas periodicamente. A amostra era centrifugada por 5min a 5500rpm a 5ºC. No sobrenadante foram determinadas as concentrações de etanol, de açúcares redutores totais (ART), de glicose, de glicerol e a atividade enzimática da glicoamilase. A concentração celular (X) foi obtida através da determinação de massa seca de células do material retido após filtração da amostra centrifugada, em membrana de 1,2mm.
A dosagem do teor de etanol (E) foi realizada empregando-se o método da oxidação por dicromato de potássio proposto por Joslyn (1970) (Tavares, 1998). O teor de glicerol foi dosado através do Kit de triglicerídeos FS-Diasys - Diagnostics Systems. Para determinação da concentração de glicose (G), foi empregado o método enzimático da glicose oxidase com auxílio de um analisador automático, o Technicon Auto Analyser II, da Technicon Instruments Corporation. A concentração de açúcares redutores totais (S) foi determinada através do método proposto por Schmidell e Fernandes (1977), dosando-se os ART’s como glicose, após hidrólise enzimática do sobrenadante. Na determinação da atividade de glicoamilase (A) foi empregado o método proposto por Park (1969) e aperfeiçoado por Schmidell e Menezes (1986). Uma unidade de atividade enzimática (U) foi definida como a quantidade de glicoamilase que libera 1 grama de glicose, em 1 hora, a partir de solução de amido solúvel 4% (w/v), a 60°C e pH 4,2.
Os cálculos das produtividades, dos fatores de conversão e do rendimento em etanol para os ensaios descontínuos e descontínuo alimentado foram realizados a partir das equações apresentadas na Tabela 2.
Tabela 2 - Equações utilizadas nos cálculos das produtividades, dos fatores de conversão e do rendimento em etanol.
Fator de conversão substrato a célula (g/g);
clip_image002 (1)
Fator de conversão substrato a etanol (g/g)
clip_image004 (6)
Fator de conversão substrato a glicoamilase (g/g)
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Fator de conversão substrato a glicerol (g/g)
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Produtividade em célula (g/L.h)
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Velocidade média de consumo de substrato (g/L.h)
clip_image012 (8)
Produtividade em etanol (g/L.h)
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Produtividade em glicoamilase (g/(L.h))
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Produtividade em glicerol (g/L.h)
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Rendimento em etanol (%)
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Onde: St = Concentração total de substrato (ART) no reator que corresponde à massa total de ART no ensaio (inicial + alimentada) dividida pelo volume total de fermentação no ensaio descontínuo alimentado e igual à concentração inicial de ART nos ensaios descontínuos (g/L); Sf = Concentração final de substrato (ART) no reator no instante final de fermentação (g/L); G0 = concentração inicial de glicose (g/L); X0 = Concentração inicial de células (g/L); Xf = Concentração de células no instante final de fermentação (tf) (g/L); tf = instante final de fermentação (h); Ps = Velocidade média de consumo de substrato; Px = Produtividade em célula; YX/S =.Fator de conversão substrato a célula; A0.= Atividade enzimática inicial; Af = Atividade enzimática no instante final de fermentação (tf) (U/L); PA = Produtividade em glicoamilase (U/L); YA/S = Fator de conversão substrato a glicoamilase; E0 = Concentração inicial de etanol; Ef = Concentração de etanol no instante final de fermentação (tf) (g/L); PE = Produtividade em etanol; YE/S = Fator de conversão substrato a etanol; Glic0 = Concentração inicial de glicerol (g/L); Glicf = Concentração de glicerol no instante final de fermentação (tf) (g/L); YGlic/S = Fator de conversão substrato a glicerol; h = Rendimento em etanol (%).

Resultados e Discussão

Os resultados cinéticos dos ensaios descontínuo alimentado (DA), descontínuo padrão (DP) e descontínuo 1 (DP1), estão mostrados nas figuras 1 a 6 e na tabela 3.
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Figura 1. Variação da concentração de ART em função do tempo durante os ensaios DP1, DA e DP.
Figura 2. Variação da concentração de glicose em função do tempo durante os ensaios DP1, DA e DP.
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Figura 3. Variação da concentração de biomassa em função do tempo durante os ensaios DP1, DA e DP.
Figura 4. Variação da atividade de glicoamilase em função do tempo durante os ensaios DP1, DA e DP.
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Figura 5. Variação da concentração de etanol em função do tempo durante os ensaios DP1, DA1 e DP.







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Figura 6. Variação da concentração de glicerol em função do tempo durante os ensaios DP1, DA1 e DP.
De acordo com os resultados apresentados na figura 1 e na tabela 3, verifica-se que a velocidade média de consumo de substrato (PS) no ensaio DP1 foi cerca de 25% mais alta que no ensaio DP. Isto significa provavelmente que a maior quantidade de dissacarídeos e oligossacarídeos de baixo peso molecular presentes no meio que sofreu uma pré-hidrólise de 1h, proporcionou uma maior facilidade de hidrólise pela glicoamilase e conseqüentemente uma maior velocidade de consumo de glicose pela levedura. Este fato, também interferiu na concentração de etanol produzida no ensaio DP1, que de acordo com a figura 5, manteve-se acima daquelas obtidas nos demais ensaios, ao longo de todo o cultivo.
No caso do ensaio descontínuo alimentado (DA), verifica-se uma elevada concentração celular ao final da etapa de crescimento (10h) e ao final do ensaio (66h). Isto refletiu diretamente na produção de glicoamilase (Figura 4), que foi maior neste ensaio (cerca de 22% e 41% mais alta em relação àquelas obtidas nos ensaios DP e DP1, respectivamente). No entanto, o incremento no crescimento celular, observado na figura 3, não se deve somente à influência da aeração, mas também à forma de condução do processo, que possibilitou uma etapa inicial de crescimento com baixa concentração de glicose (menor que 1 g/L) (Figura 2), de forma a minimizar o “efeito Crabtree”, resultando em um crescimento exponencial bastante nítido, com velocidade específica máxima de crescimento (mX) em torno de 0,2h-1 e uma maior produção de glicoamilase. Esse fato comprova as características recombinantes da levedura, que tem a expressão gênica da glicoamilase controlada pelo promotor PGK (gene da fosfogliceratoquinase) que é constitutivo e, portanto, quanto maior o crescimento, maior a produção da enzima.
Em relação à produção de etanol, observa-se que a concentração final de etanol alcançada no ensaio DA, foi de cerca de 42,56 g/L, com um rendimento em torno de 54% em relação ao teórico, cerca de 24% mais baixo do que os obtidos nos ensaios descontínuos DP e DP1 (cerca de 71% em relação ao teórico). Considerando o tempo final de fermentação igual ao final da fonte de carbono, observa-se que no ensaio descontínuo alimentado DA, apesar da maior produtividade em células e em glicoamilase (Tabela 3), a produtividade em etanol foi um pouco menor do que no ensaio DP1 e cerca de 14% maior do que no ensaio padrão DP. Porém, considerando-se somente a etapa fermentativa, ou seja, no intervalo entre 10 e 42 horas de cultivo obtêm-se uma produtividade em etanol (PE = 1,23 g/L.h), cerca de 14% e 45% maior do que as obtidas nos ensaios DP1 e DP, respectivamente. Entretanto, o rendimento em etanol obtido nesta fase (h = 59,37%), também foi significativamente menor do que nos demais ensaios, indicando que parte da glicose proveniente da hidrólise do amido, por ação da glicoamilase, foi desviada preferencialmente para o crescimento e outros produtos, prejudicando assim, a produção de etanol. De fato, a figura 6 e a Tabela 3 mostram concentrações de glicerol (em torno de 14 g/L) e fatores de conversão de substrato a glicerol relativamente altos em todos os ensaios, tendo em vista o pH do meio (pH = 4,5), uma vez que, de acordo com Martinez (2000) utilizando S. cerevisiae comercial para a produção de glicerol, fatores de conversão similares foram obtidos utilizando meio com pH em torno de 6,5.
Tabela 3. Resultados cinéticos obtidos a partir dos ensaios DP1, DA e DP.
Parâmetros (*)Ensaios
DP1DADP
Condições da etapa de sacarificação80ºC/1h80ºC/ 10min80ºC/10min
S0 (g/L)165,0018,00161,50
Sf (g/L)5,302,805,40
St (g/L)165,00150,70161,50
G0 (g/L)3,300,503,70
X0 (g/L)0,680,840,65
Xf (g/L)12,1213,4210,40
Tf (h)54,0042,0066,00
PS (g/L.h)2,963,522,36
Px (g/L.h)0,210,300,15
Yx/s0,070,090,06
A0 (U/L)4,502,001,31
Af (U/L)45,8064,4052,85
PA(U/L.h)0,771,480,78
YA/S0,260,420,33
E0 (g/L)1,001,941,10
Ef (g/L)59,1742,5657,51
PE (g/L.h)1,080,970,85
YE/S0,350,270,36
h (%) em etanol71,3053,7470,73
Glicerol01,370,800,75
Glicerolf13,8213,1415,20
Pglic (g/L.h)0,230,290,22
Yglic/s0,080,080,09

(*) Descrição dos parâmetros: ver Tabela 2
De acordo com os resultados globais apresentados na tabela 3, pode-se verificar que o ensaio realizado com meio preparado a partir de um xarope de farinha de mandioca que sofreu dextrinização por 1h (ensaio DP1), apresentou um rendimento similar ao obtido no ensaio padrão DP e uma maior produtividade em etanol, cerca de 27% mais elevada que o ensaio DP. Isso indica que, provavelmente, a dextrinização realizada, gerou moléculas menores de oligossacarídeos e isso fez com que a ação da glicoamilase fosse facilitada, disponibilizando uma concentração de glicose em torno de 1 g/L no meio durante todo o cultivo (Figura 2).

CONCLUSÕES
Tendo em vista todas as hipóteses e resultados dos ensaios, constata-se que a etapa de dextrinização é muito importante para o processo, pois é ela que vai determinar as quantidades de oligossacarídeos e de glicose presentes no meio em cada instante e, portanto, aumentar a velocidade de produção de etanol pela levedura recombinante. Além disso, é interessante para o processo de fermentação, aumentar a quantidade inicial de células a fim de permitir uma elevada atividade em glicoamilase no início do processo fermentativo. Desta forma, é possível obter maiores produtividades em etanol resultantes de uma maior velocidade de hidrólise.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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